Este protocolo pode ser usado para avaliar a integridade e plasticidade de uma junção neuromuscular em condições normais e patológicas. Esta técnica é para rotular simultaneamente as células Schwann e animais pré e pós-laboratório em seções musculares únicas. Depois de eutanásia o rato macho adulto, coloque o rato no capô e abra a cavidade torácica para acessar o coração usando tesouras e fórceps.
Insira e cateter intravenoso do ventrículo cardíaco esquerdo em direção à aorta e corte o oráculo direito. Em seguida, inicie a perfusão com 100 mililitros de soro fisiológico 0,9% normal até que o sangue que sai do oráculo direito esteja claro. Em seguida, continue a perfuse com 250 a 300 mililitros de 4% paraformaldeído em 0,1 tampão de fosfato molar ou pH PB 7,4 por 10 minutos.
Após a perfusão, remova a pele do membro traseiro bilateral usando uma lâmina cirúrgica e exponha o nervo ciático bilateral e o músculo gastrocnemius medial. Disseque o músculo gastrocnemius medial bilateral cuidadosamente do membro traseiro usando uma lâmina e poste o músculo inteiro em 10 mililitros de 4%paraformaldeído. Após duas horas, remova o músculo da solução e crioproteta-o em 10 mililitros de 25% de sacarose em 0,1 pb molar por um dia a quatro graus celsius.
Uma vez que o tecido muscular esteja imerso na solução de sacarose, fixe-o em um estágio de congelamento de um sistema de microtome deslizante usando um meio de seção congelado. Corte o músculo horizontalmente ao longo do longo eixo do músculo na espessura de 80 míccros. Usando um pincel, coloque sete seções criogenas por poço de forma ordenada em uma placa de seis poços de cultura com 10 mililitros de 0,1 molar PB. Para coloração fluorescente, incuba quatro seções por poço com 1,5 mililitros de PB molar de 0,1 contendo 75 microliters de 10% Triton X 100 e 45 microliters de soro normal de burro em um agitador orbital a 20 rpm.
Após 30 minutos, transfira as seções em 1,5 mililitros de uma solução mista de anticorpos primários contendo filamento anti-neuro de coelho 200, transporte anti-acetilcholina de cabra em 0,1 molar PB, em 1%soro de burro normal, e 0,5% Triton X 100 e incubar durante a noite em quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as seções três vezes por cinco minutos cada em 0,1 molar PB em agitador orbital a 20 rpm. Após a última lavagem, incubar a seção em uma solução mista de anticorpos secundários contendo anti-coelho burro AF 488 e anti-cabra burro AF 546, bem como os biomarcadores de alfa bungaro toxina AF 647 e falo 350 contendo em 0,1 M PB contendo 1%soro de burro normal e 0,5 Triton x 100 por uma hora, Protegendo-os da luz.
Após a incubação, lave as seções em PB e monte-as em um slide de microscópio. Aplique vidro de cobertura na seção usando 50% de glicerina em água destilada. Observe e imagem da amostra usando um sistema de imagem focal con equipado com uma lente subjetiva de 20 x com uma abertura numérica de 0,75 e uma lente de 40 x com abertura numérica de 0,95.
Para múltiplas imagens fluorescentes, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão de cada biomarcador conforme descrito no manuscrito do texto. Defina a resolução da captura de imagem para 640 por 640 pixels. Em seguida, defina o plano focal de partida e fim.
Defina o tamanho do passo para um ou dois mícrons. Em seguida, escolha padrão de profundidade, captura de imagem e sérieS Z. Para as imagens de ampliação inferior em 20 X, capture imagens de pilha de 40 Z em tamanho de passo de dois mícrons usando um pinhole de 105 mícrons.
Escolha o modo de projeção ou topografia e projeção de intensidade sobre o eixo Z para integrar todas as imagens em um único foco. Para as imagens de ampliação mais altas em 40 X, capture imagens de pilha de 80 Z em um tamanho de passo de míccro com zoom definido para dois e um pinhole de 105 mícrons. Integre todas as imagens em um único foco.
Reconstrua as imagens no padrão tridimensional com o sistema de processamento de imagens. A correlação espacial representativa do músculo gastrocnemius medial com filamento neuro filamento 200 fibras nervosas positivas, transporte de acetilcolina vesicular terminal pré-sináptico positivo, toxina alfa bungaro positivo receptores de acetilcolina pós-sináptica, células schwann perisinápticas positivas S100, fibras musculares positivas de fhalloidina e dopi rotulados O neurofilamento 200 fibras nervosas positivas correu em feixe.
Essas fibras nervosas deram ramificações aos terminais pré-sinápticos pré-sinápticos de acetilcolina vesicular, que formaram uma relação espelhada com os receptores de acetilcolina pós-sináptica de toxina alfa bungaro. Além disso, as células Schwann perisinápticas perisinápticas positivas S100 foram detectadas em torno do neurofilamento 200 fibras nervosas positivas perto dos terminais pré-sinápticos. A correlação espacial foi ainda exibida em um padrão tridimensional mostrando as características morfológicas detalhadas da junção neuromuscular de diferentes perspectivas.
Para observar mais imagens em seções musculares, é fundamental cortar o músculo horizontalmente ao longo do eixo longo com uma espessura de 80 mícrons.
