Questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'integrità e la plasticità di una giunzione neuromuscolare in condizioni normali e patologiche. Questa tecnica è quella di etichettare contemporaneamente le cellule di Schwann e gli animali pre e post laboratorio su singole sezioni muscolari. Dopo l'eutanasia del ratto maschio adulto, posizionare il ratto nel cappuccio e aprire la cavità toracica per accedere al cuore usando forbici e pinze.
Inserire e catetere endovenoso dal ventricolo cardiaco sinistro verso l'aorta e tagliare l'oracolo destro. Quindi, iniziare la perfusione con 100 millilitri di 0,9% di soluzione salina normale fino a quando il sangue che esce dall'oracolo destro è chiaro. Quindi continuare a perfondere con 250-300 millilitri di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato molare 0,1 o PB pH 7,4 per 10 minuti.
Dopo la perfusione, rimuovere la pelle dell'arto posteriore bilaterale utilizzando una lama chirurgica ed esporre il nervo sciatico bilaterale e il muscolo gastrocnemio mediale. Sezionare accuratamente il muscolo gastrocnemio mediale bilaterale dall'arto posteriore usando una lama e postfiggere l'intero muscolo in 10 millilitri di paraformaldeide al 4%. Dopo due ore, rimuovere il muscolo dalla soluzione e crioproteggerlo in 10 millilitri di saccarosio al 25% in 0,1 PB molare per un giorno a quattro gradi Celsius.
Una volta che il tessuto muscolare è immerso nella soluzione di saccarosio, fissarlo su uno stadio di congelamento di un sistema di microtomo scorrevole utilizzando un mezzo di sezione congelato. Affettare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo del muscolo allo spessore di 80 micron. Usando un pennello, posizionare sette sezioni criometriche per pozzetto in modo ordinato in una piastra di coltura a sei pozzetti con 10 millilitri di 0,1 PB molare. Per la colorazione fluorescente, incubare quattro sezioni per pozzetto con 1,5 millilitri di PB molare 0,1 contenenti 75 microlitri del 10% di Triton X 100 e 45 microlitri di normale siero d'asino su uno shaker orbitale a 20 giri / min.
Dopo 30 minuti, trasferire le sezioni in 1,5 millilitri di una soluzione mista di anticorpi primari contenenti filamento anti-neuro di coniglio 200, trasportatore di acetilcolina anti-vescicolare di capra in 0,1 PB molare, in siero d'asino normale all'1% e 0,5% Triton X 100 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna in 0,1 PB molare su scuotitore orbitale a 20 giri / min. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la sezione in una soluzione mista di anticorpi secondari contenenti asino anti-coniglio AF 488 e asino anti-capra AF 546, nonché i biomarcatori della tossina alfa bungaro AF 647 e falloidina 350 contenenti in 0,1 M PB contenenti l'1% di siero d'asino normale e 0,5 Triton x 100 per un'ora, Proteggerli dalla luce.
Dopo l'incubazione, lavare le sezioni in PB e montarle su un vetrino per microscopio. Applicare il vetro di copertura sulla sezione utilizzando il 50% di glicerina in acqua distillata. Osservare e fotografare il campione utilizzando un sistema di imaging con focale dotato di un obiettivo soggettivo 20 x con un'apertura numerica di 0,75 e un obiettivo 40 x con un'apertura numerica di 0,95.
Per l'imaging fluorescente multiplo, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di ciascun biomarcatore come descritto nel manoscritto di testo. Impostare la risoluzione dell'acquisizione dell'immagine su 640 x 640 pixel. Quindi, impostare il piano focale iniziale e finale.
Impostare la dimensione del passo su uno o due micron. Quindi scegli il modello di profondità, l'acquisizione dell'immagine e la serie Z. Per le immagini a basso ingrandimento a 20 X, acquisire immagini stack 40 Z in due micron step utilizzando un foro stenopeico da 105 micron.
Scegli la modalità di proiezione o topografia e la proiezione di intensità sull'asse Z per integrare tutte le immagini in un'unica messa a fuoco. Per le immagini con ingrandimento più elevato a 40 X, cattura immagini stack 80 Z in un passo micron con zoom impostato su due e un foro stenopeico da 105 micron. Integra tutte le immagini in un'unica messa a fuoco.
Ricostruire le immagini nel modello tridimensionale con il sistema di elaborazione delle immagini. La correlazione spaziale rappresentativa del muscolo gastrocnemio mediale con il filamento neuro 200 fibre nervose positive, il terminale pre-sinaptico positivo del trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, il terminale pre-sinaptico positivo alla tossina alfa bungaro, i recettori dell'acetilcolina post-sinaptica positiva alla tossina alfa bungaro, le cellule di Schwann perisinaptiche S100 positive, le fibre muscolari positive alla falloidina e i nuclei cellulari marcati DAPI sono dimostrati qui. Il neurofilamento 200 fibre nervose positive correva in fascio.
Queste fibre nervose hanno dato rami ai terminali presinaptici positivi del trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, che formavano una relazione speculare con i recettori dell'acetilcolina post-sinaptica positiva della tossina alfa bungaro. Inoltre, le cellule di Schwann perisinaptiche S100 positive sono state rilevate intorno al neurofilamento 200 fibre nervose positive vicino ai terminali pre-sinaptici. La correlazione spaziale è stata ulteriormente esposta in un modello tridimensionale che mostra le caratteristiche morfologiche dettagliate della giunzione neuromuscolare da diverse prospettive.
Per osservare più immagini nelle sezioni muscolari, è fondamentale tagliare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo ad uno spessore di 80 micron.
