יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

טכניקה זו יכולה לדמות מיאלין בקטעי רקמת המוח. מיאלינציה ממלאת תפקיד חשוב בהולכה של פוטנציאל פעולה והבנת המיאלין תעזור לנו להבין את תפקוד המוח. היתרון העיקרי של טכניקת CARS על פני, למשל, מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא ש- CARS היא טכניקת מיקרוסקופיה קלה, וניתן לשלב אותה בקלות עם הדמיה פלואורסצנטית אחרת, כגון המשמשת באימונוהיסטוכימיה.

מספר מצבים רפואיים נובעים משינויים במיאלינציה, למשל, טרשת נפוצה, הזדקנות ואוטיזם. הבנת השינויים הללו תעזור לנו להבין את הבעיות הרפואיות הבסיסיות. במקרה זה, לייזר CARS מכוון לתמונה שומנים או, במיוחד, אג"ח CH2.

במוח, המקור הגדול ביותר של שומנים הוא המיאלין. לכן, זוהי טכניקה כדי לדמיין מיאלין ברקמת המוח. זה צריך להיות אפשרי להשתמש באותה שיטה עבור סוגים אחרים של רקמות כאשר הדמיה שומנים הוא עניין.

כוונון ויישור לייזר CARS דורש מומחיות משמעותית, והוא מבוצע בצורה הטובה ביותר על ידי מומחה לייזר או מיקרוסקופיה קלה. לאחר הכנת הרקמות כפי שמתואר בכתב היד, יש להכתים חתכים שצפים בחופשיות עבור משקעי ניסל ונוגדנים כדי לדמיין את גופי התאים, ולאחר מכן לדגור את החלקים על שייקר מעבדה סטנדרטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לפני הבאת הדגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר ה- CARS למשך שעה אחת לפחות, ולאחר מכן יישר את לייזר ה- CARS על ידי חפיפה מרחבית של קרני הלייזר של המשאבה והסטוקס, וכוונן את ההשהיה בין שתי קרני הלייזר.

צבעו את אופטיקת המעבה ואת הסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדמית, ולאחר מכן התאימו את הפריסקופ החיצוני כך שירכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ. לזיהוי הטוב ביותר של CARS קדימה ללא ייבוש. ודא שהמעבה מתפתה בצבע.

עבור אימונופלואורסצנציה, הדמיה קונפוקלית והדמיית מכוניות, התאימו את לייזר ה-CARS עם גלאים קדמיים ואפי-CARS שאינם מנוקבים על ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיית פלואורסצנציה. כעת, הניחו את החלקים בצלחת תרבית עם תחתית מחליק כיסוי, ו- PBS כדי למנוע ייבוש הרקמה. כמו כן, השתמש במשקל זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי להחליק.

באמצעות ממשק המשתמש הגרפי, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה עבור מכוניות והדמיית פלואורסצנציה של טילים. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, מקדו את הדגימה ותפסו את התמונות. טווח הספקטרום של CARS נע בין 640 ל-660 ננומטר, ונראה שאין חפיפה בספקטרום עם סמן אימונופלואורסצנטי המתויג על-ידי ניסל, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש באותות CARS עם אותות אימונופלואורסצנטיים.

ניסל שימשה להדמיה של גופי התאים של מוחות גרביל ועכברים מונגולים, וההדמיה של CARS שימשה להמחשת מעטפת המיאלין, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו על פני מינים שונים. שתי קבוצות התמונות מציגות מקטע של הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז בגזע המוח. הרזולוציה של CARS נמוכה יותר מאשר במיקרוסקופ אלקטרונים והיא בסדר גודל של כמה מאות ננומטרים.

ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית, כגון ImageJ כדי לכמת את הפרמטרים המעניינים, למשל, עובי או אורך המיאלין.