コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

この技術は、脳組織切片中のミエリンを画像化することができる。髄鞘形成は活動電位の伝導に重要な役割を果たしており、ミエリンを理解することは脳機能を理解するのに役立ちます。例えば、電子顕微鏡法に対するCARS技術の主な利点は、CARSが光学顕微鏡技術であり、免疫組織化学で使用されるような他の蛍光イメージングと容易に組み合わせることができることである。

いくつかの病状は、多発性硬化症、加齢、自閉症などの髄鞘形成の変化によるものです。これらの変化を理解することは、根本的な病状を理解するのに役立ちます。この場合、CARSレーザーは脂質、具体的にはCH2結合を画像化するように調整されます。

脳では、脂質の最大の供給源はミエリンです。したがって、これは脳組織中のミエリンを画像化する技術である。脂質のイメージングが関心のある場合は、他の種類の組織にも同じ方法を使用できるはずです。

CARSレーザーのチューニングとアライメントにはかなりの専門知識が必要であり、レーザーまたは光学顕微鏡の専門家が行うのが最適です。原稿に記載されているように組織を調製した後、細胞体を視覚化するためにニセルおよび抗体培地のために浮遊切片を染色し、次いで標準的な実験室用シェーカーで室温で30分間インキュベートする。サンプルを顕微鏡に持ち込む前に、CARSレーザーの電源を入れて少なくとも1時間ウォームアップし、ポンプとストークスレーザービームを空間的に重ね合わせてCARSレーザーを位置合わせし、2つのレーザービーム間の遅延を調整します。

コンデンサー光学系と顕微鏡のダイアフラムを前方CARSイメージング用に着色し、外部潜望鏡を調整して、空間的に重なり合った2つのレーザーを顕微鏡のスキャンヘッドミラーの中央に配置します。最高の前方CARS非スキャン検出のために。コンデンサーが色に誘われていることを確認してください。

免疫蛍光、共焦点イメージング、およびCARイメージングでは、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込むことにより、CARSレーザーを前方およびエピCARS非デススキャン検出器の両方に適合させます。次に、切片をカバースリップ底のある培養皿に入れ、組織の乾燥を避けるためにPBSを入れます。また、ガラスの重りを使用して、ティッシュをカバースリップの近くに保ちます。

グラフィックユーザーインターフェイスを使用して、自動車およびミサイル蛍光共焦点イメージングの画像取得パラメータを設定します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、サンプルに焦点を合わせて画像をキャプチャします。CARSのスペクトルは640〜660ナノメートルの範囲であり、ナイセルタグ付き免疫蛍光マーカーとのスペクトルの重複はないようであり、CARSシグナルを免疫蛍光シグナルで使用できることを示しています。

Niselはモンゴルスナネズミとマウスの脳の細胞体を視覚化するために使用され、CARSのイメージングはミエリン鞘を視覚化するために使用され、この技術が種を超えて使用できることを示しています。両方の画像セットは、脳幹の台形体の内側核のセクションを示しています。CARSの分解能は電子顕微鏡よりも低く、数百ナノメートルのオーダーです。

画像は、ImageJなどの標準的な画像解析ソフトウェアで分析して、目的のパラメータ、例えばミエリンの厚さまたは長さを定量化することができる。