Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Esta técnica pode visualizar a mielina em seções de tecido cerebral. A mielinização desempenha um papel importante na condução dos potenciais de ação e a compreensão da mielina nos ajudará a entender a função cerebral. A principal vantagem da técnica CARS sobre, por exemplo, a microscopia eletrônica é que a CARS é uma técnica de microscopia de luz, e pode ser facilmente combinada com outras imagens de fluorescência, como as usadas em imuno-histoquímica.

Várias condições médicas são devidas a alterações na mielinização, por exemplo, esclerose múltipla, envelhecimento e autismo. Entender essas alterações nos ajudará a entender as condições médicas subjacentes. Neste caso, o laser CARS é sintonizado para lipídios de imagem ou, especificamente, ligações CH2.

No cérebro, a maior fonte de lipídios é a mielina. Assim, esta é uma técnica para a imagem da mielina no tecido cerebral. Deve ser possível usar o mesmo método para outros tipos de tecido quando a imagem lipídios é de interesse.

O ajuste e o alinhamento do laser CARS exigem experiência significativa e são melhor realizados por um especialista em laser ou microscopia de luz. Depois de preparar os tecidos, conforme descrito no manuscrito, core seções flutuantes livres para nisel e meios de anticorpos para visualizar os corpos celulares e, em seguida, incube as seções em um agitador de laboratório padrão por 30 minutos à temperatura ambiente. Antes de trazer as amostras para o microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos uma hora, alinhe o laser CARS sobrepondo espacialmente a bomba e alimentando os feixes de laser e ajuste o atraso entre os dois feixes de laser.

Colora a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS avançadas e, em seguida, ajuste o periscópio externo para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos de cabeça de varredura do microscópio. Para melhor encaminhamento CARS detecção não descartada. Certifique-se de que o condensador é atraído por cores.

Para imunofluorescência, imagens confocais e imagens de carros, ajuste o laser CARS com detectores não descantados CARS para frente e epi CARS, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagens de fluorescência. Agora, coloque as seções em um prato de cultura com um fundo deslizante de cobertura e PBS para evitar a secagem do tecido. Além disso, use um peso de vidro para manter o tecido perto do deslizamento da tampa.

Usando a interface gráfica do usuário, defina os parâmetros de aquisição de imagem para carros e imagens confocais de fluorescência de mísseis. Coloque a amostra no estágio do microscópio, foque a amostra e capture as imagens. Os espectros do CARS variam de 640 a 660 nanômetros e parece não haver sobreposição nos espectros com o marcador imunofluorescente marcado com nisel, indicando que os sinais CARS podem ser usados com sinais imunofluorescentes.

O Nisel foi usado para visualizar os corpos celulares de gerbil mongol e cérebros de camundongos, e a imagem do CARS foi usada para visualizar a bainha de mielina, indicando que essa técnica poderia ser usada em todas as espécies. Ambos os conjuntos de imagens mostram uma seção do núcleo medial do corpo trapézio no tronco cerebral. A resolução do CARS é menor do que com o microscópio eletrônico e é da ordem de várias centenas de nanômetros.

As imagens podem ser analisadas com um software de análise de imagem padrão, como o ImageJ para quantificar os parâmetros de interesse, por exemplo, espessura ou comprimento da mielina.