Этот метод может визуализировать миелин в участках мозговой ткани. миелинизация играет важную роль в проведении потенциалов действия, и понимание миелина поможет нам понять функцию мозга. Основным преимуществом метода CARS перед, например, электронной микроскопией является то, что CARS является методом световой микроскопии и может легко сочетаться с другими флуоресцентными изображениями, такими как используемые в иммуногистохимии.
Некоторые медицинские условия связаны с изменениями в миелинизации, например, рассеянный склероз, старение и аутизм. Понимание этих изменений поможет нам понять основные медицинские условия. В этом случае лазер CARS настраивается на изображение липидов или, в частности, связей CH2.
В головном мозге крупнейшим источником липидов является миелин. Таким образом, это техника для изображения миелина в мозговой ткани. Должна быть возможность использовать тот же метод для других типов тканей, когда визуализация липидов представляет интерес.
Настройка и выравнивание лазера CARS требует значительных знаний и лучше всего выполняется экспертом по лазерной или световой микроскопии. После подготовки тканей, как описано в рукописи, окрашивают свободно плавающие срезы для сред низеля и антител для визуализации клеточных тел, затем инкубируют срезы на стандартном лабораторном шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре. Прежде чем принести образцы в микроскоп, включите и разогрейте лазер CARS в течение не менее одного часа, затем выровняйте лазер CARS, пространственно перекрывая накачку и топит лазерные лучи, и отрегулируйте задержку между двумя лазерными лучами.
Раскрасьте оптику конденсатора и диафрагму микроскопа для прямого изображения CARS, затем отрегулируйте внешний перископ, чтобы центрировать пространственно перекрывающиеся два лазера на сканирующих головных зеркалах микроскопа. Для наилучшего прямого обнаружения CARS без сканирования. убедитесь, что конденсатор окрашен в цвет.
Для иммунофлуоресценции, конфокальной визуализации и визуализации автомобилей установите лазер CARS как с прямыми, так и с эпи CARS недесканированными детекторами, включив конфокальный микроскоп, оснащенный видимыми лазерами для флуоресцентной визуализации. Теперь поместите секции в культуральную посуду с крышкой скользящего дна и PBS, чтобы избежать высыхания ткани. Кроме того, используйте стеклянную массу, чтобы держать ткань рядом с крышкой.
Используя графический пользовательский интерфейс, задайте параметры получения изображения для автомобилей и ракетной флуоресцентной конфокальной визуализации. Поместите образец на ступень микроскопа, сфокусируйте образец и захватите изображения. Спектры CARS варьируются от 640 до 660 нанометров, и, по-видимому, нет перекрытия спектров с иммунофлуоресцентным маркером, помеченным низелем, что указывает на то, что сигналы CARS могут использоваться с иммунофлуоресцентными сигналами.
Нисель использовался для визуализации клеточных тел монгольской песчанки и мозга мыши, а визуализация CARS использовалась для визуализации миелиновой оболочки, что указывает на то, что этот метод может быть использован для разных видов. Оба набора изображений показывают участок медиального ядра трапециевидного тела в стволе мозга. Разрешение CARS ниже, чем при электронном микроскопе и составляет порядка нескольких сотен нанометров.
Изображения могут быть проанализированы с помощью стандартного программного обеспечения для анализа изображений, такого как ImageJ, для количественной оценки интересующих параметров, например, толщины или длины миелина.
