Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Bu teknik, miyelini beyin dokusu bölümlerinde görüntüleyebilir. miyelinasyon, aksiyon potansiyellerinin iletilmesinde önemli bir rol oynar ve miyelini anlamak, beyin fonksiyonlarını anlamamıza yardımcı olacaktır. CARS tekniğinin elektron mikroskobuna göre temel avantajı, CARS'ın hafif bir mikroskopi tekniği olması ve immünohistokimyada kullanıldığı gibi diğer floresan görüntüleme ile kolayca birleştirilebilmesidir.

Çeşitli tıbbi durumlar, örneğin multipl skleroz, yaşlanma ve otizm gibi miyelinasyondaki değişikliklerden kaynaklanmaktadır. Bu değişiklikleri anlamak, altta yatan tıbbi durumları anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu durumda, CARS lazer görüntü lipitlerine veya özellikle CH2 bağlarına ayarlanır.

Beyinde, en büyük lipit kaynağı miyelindir. Bu nedenle, bu beyin dokusunda miyelini görüntülemek için kullanılan bir tekniktir. Lipitlerin görüntülenmesi ilgi çekici olduğunda diğer doku tipleri için aynı yöntemi kullanmak mümkün olmalıdır.

CARS lazerinin ayarlanması ve hizalanması önemli uzmanlık gerektirir ve en iyi şekilde bir lazer veya ışık mikroskobu uzmanı tarafından gerçekleştirilir. Dokuları makalede açıklandığı gibi hazırladıktan sonra, hücre cisimciklerini görselleştirmek için nisel ve antikor ortamı için serbest yüzen bölümleri lekeleyin, ardından bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca standart bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Örnekleri mikroskopa getirmeden önce, CARS lazerini en az bir saat boyunca açın ve ısıtın, ardından pompayı uzamsal olarak üst üste bindirerek CARS lazerini hizalayın ve lazer ışınlarını stoklayın ve iki lazer ışını arasındaki gecikmeyi ayarlayın.

İleriye dönük CARS görüntüleme için kondenser optiklerini ve mikroskobun diyaframını renklendirin, ardından dış periskopu mekansal olarak üst üste binen iki lazeri mikroskobun tarama kafası aynalarına ortalayacak şekilde ayarlayın. En iyi ileri CARS taranmamış algılama için. kondenserin renk ayarlı olduğundan emin olun.

İmmünofloresan, konfokal görüntüleme ve araba görüntüleme için, floresan görüntüleme için görünür lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop ekleyerek CARS lazerini hem ileri hem de epi CARS taramasız dedektörlerle donatın. Şimdi, dokuyu kurutmaktan kaçınmak için bölümleri kapak kayması dibi ve PBS olan bir kültür kabına yerleştirin. Ayrıca, dokuyu kapak kaymasına yakın tutmak için bir cam ağırlığı kullanın.

Grafik kullanıcı arayüzünü kullanarak, otomobiller ve füze floresan konfokal görüntüleme için görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin, örneği odaklayın ve görüntüleri yakalayın. CARS'ın spektrumları 640 ila 660 nanometre arasında değişmektedir ve CARS sinyallerinin immünofloresan sinyallerle kullanılabileceğini gösteren nisel etiketli immünofloresan işaretleyici ile spektrumlarda örtüşme olmadığı görülmektedir.

Nisel, Moğol gerbil ve fare beyinlerinin hücre gövdelerini görselleştirmek için kullanıldı ve CARS'ın görüntülemesi, miyelin kılıfını görselleştirmek için kullanıldı ve bu tekniğin türler arasında kullanılabileceğini gösterdi. Her iki görüntü seti de beyin sapındaki yamuk cismin medial çekirdeğinin bir bölümünü göstermektedir. CARS'ın çözünürlüğü elektron mikroskobundan daha düşüktür ve birkaç yüz nanometre mertebesindedir.

Görüntüler, miyelin kalınlığı veya uzunluğu gibi ilgili parametreleri ölçmek için ImageJ gibi standart görüntü analiz yazılımı ile analiz edilebilir.