השיטה שלנו מאפשרת למדוד נטייה להסתיידות של דגימות מטופלים באמצעות תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים. זה יעזור להניע מחקר על הפרעות הסתיידות כלי הדם, סיוע בפיתוח של טיפולים חדשים. טכניקה זו משתמשת בזיהוי מבוסס פלואורסצנט, אשר מגביר את הרגישות ומאפשר למדוד דגימות לאורך זמן, ובכך להפחית את הצורך בשכפולים ולהגדיל את החוסן.
בתור התחלה, תרבית תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים על תרבית תאים לא מצופים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. פצלו את התאים כדי להגיע ל-70% עד 90% מפגש. כדי לפצל, לשטוף את HVSMCs פעמיים עם PBS.
יש להוסיף טריפסין ולדגירה במשך 2 עד 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לעכב את תגובת הטריפסין על ידי הוספת סרום המכיל מדיום. צנטריפוגה של התאים במשך 4 דקות ב 350 RCF ולתלות את הכדור במדיום תחזוקה.
לאחר הכנת התאים לפיצול כפי שהודגם, ספרו וזרעו את התאים לצלחת של 48 בארות כדי להתחיל בניסוי ההסתיידות. לאחר דגירה לילית ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, יש לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS, תוך שאיפה זהירה של כל ה-PBS הנותרים לאחר השטיפה השנייה. מוסיפים בעדינות מדיום הסתיידות ומדגרים עוד יותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
יש לבדוק מדי יום במיקרוסקופ אור עד להתרחשות ההסתיידות. כדי לזהות הסתיידות באמצעות הדמיה, פתח את התוכנה ובחר פרוטוקולים וצור חדש. בחר הליך ולחץ על הגדר טמפרטורה.
הגדר את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס ואת השיפוע ל- 1 מעלות צלזיוס בחלון המוקפץ ולחץ על אישור. בחר את סוג הצלחת לבחירה מהתפריט הנפתח. הוסף את שלב ההדמיה על-ידי לחיצה על תמונה. בחרו בתמונה ההפוכה ולחצו על הלחצן 'אשר'. הוסף שלושה ערוצי הדמיה והגדר אותם ל- DAPI, RFP ו- Bright Field.
סמן את תיבת מונטאז 'והגדר את המספר והמיקום הרצויים של התמונות. שנה את החפיפה כדי לייצג כיסוי טוב יותר של כל באר. בחר אילו בארות יש לדמות.
ייפתח חלון חדש שבו ניתן יהיה לבחור את הבארות המעניינות. לחצו על 'אפשרויות מיקוד' כדי להגדיר את מצב המיקוד. חלון חדש ייפתח.
הגדר כל ערוץ בנפרד. בדרך כלל, בארות ממוקדות אוטומטית בערוץ DAPI. הגדר את כל הערוצים האחרים לגובה מוקד קבוע מהערוץ הראשון והגדר על-ידי לחיצה על אישור. סגור את החלון.
התחל את שלבי הפחתת הנתונים המוגדרים מראש על-ידי לחיצה על הפחתת נתונים ובחר עיבוד מקדים של תמונה. קבל את הגדרות ברירת המחדל על-ידי בחירה באפשרות אישור. הגדר שלב לספירת התאים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח סלולארי. בחר תמונות TsF DAPI מהתפריט הנפתח של הערוץ.
הגדר פרטים נוספים לאחר ביצוע ההדמיה. הכן את הניתוח של אות ה- RFP על-ידי בחירה באפשרות סטטיסטיקה בחלון המוקפץ שלב תווית ובחר TsF RFP כערוץ הקלט. סמן את התיבות ערך עליון וערך תחתון.
סמן את התיבה עבור שטח כולל ברשימה התחתונה. בחרו 'ללא' בעמודה 'אפקט צבע'. בחלון המוקפץ, לחץ על מותאם אישית וסמן את התיבה רקע.
לחץ על OK. לקריאה הוגנת, נרמל את אות ה- RFP לכל תא על-ידי לחיצה על Ratio בצד שמאל. בחלון המוקפץ, בחר שטח כולל של כימות RFP. עבור קלט נתונים 1 מהתפריט הנפתח ובחר ספירת תאים כקלט נתונים 2.
לבסוף, בחר שם ערכת נתונים חדש ולחץ על אישור פעמיים. בחרו 'אפקט צבע' כפי שהודגם קודם לכן, לחצו OK.In בפינה השמאלית העליונה, בחרו 'קובץ' ושמרו את הקובץ כסוג קובץ Protocol. רשום תצפיות עבור כל נקודת זמן לאחר התרחשות המופע הראשון של הסתיידות.
לחץ על קרא עכשיו בתוכנת ההפעלה ולחץ על פרוטוקול קיים. בחר את הפרוטוקול שנוצר בשלב הקודם. התוכנית תבקש לשמור את הניסוי.
ניתן לעשות זאת בשלב זה או מאוחר יותר באופן ידני על ידי לחיצה על להציל כפתור בפינה השמאלית העליונה. חלון קופץ יבקש להמתין עד שהמערכת תתחמם. הפעל את בקר גז הפחמן הדו חמצני והגדר אותו ל -5% לאחר שהמערכת הגיעה לטמפרטורה שנקבעה, תופיע הנחיה להכניס צלחת ולקרוא.
לחץ על ביטול. העבירו את הצלחת מהאינקובטור אל ההדמיה בכספת כדי למנוע שבירה ושפיכה, והיא עולה בקנה אחד עם תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות להובלת תאים חיים במקרה של תאונה. הכניסו את הצלחת לקורא הצלחות.
לחץ על נוהל. בחלון המוקפץ, בחרו 'שלב הדמיה מוגדר מראש'. התאם תחילה את המיקוד והחשיפה בערוץ DAPI.
נקה את התיבה חשיפה אוטומטית בכל הערוצים ולאחר מכן לחץ על סמל המיקרוסקופ לצד ערוץ DAPI. חלון חדש ייפתח. בחר את הבאר כדי לכוון את המיקוד.
אם אות כבר גלוי, תחילה, לחץ על מיקוד אוטומטי ולאחר מכן על חשיפה אוטומטית. אם לא, תחילה, הגדל את החשיפה וחזור על המיקוד האוטומטי ועל החשיפה האוטומטית. ניתן לכוונן את החשיפה באופן ידני על-ידי בחירה בתפריט הנפתח חשיפה.
בדוק את ההגדרות במספר בארות ולאחר מכן שמור את ההגדרות. התאם את החשיפה באותו אופן לכל הערוצים. עבור ערוץ RFP, הקפד להתחיל עם באר עם הסתיידות בינונית עד גבוהה.
סגור את חלון ההליך ובחר בלחצן הירוק קרא עכשיו בשורת המשימות העליונה. שמור את הניסוי כפי שצוין על ידי התוכנה. חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן.
בזמן שהמערכת קוראת את הצלחת, כל התמונות מעובדות באופן אוטומטי ברקע. התאם את ההגדרות עבור ספירת תאים על-ידי בחירת תמונות TsF DAPI להצגה. בחר את הבאר המועדפת על-ידי לחיצה כפולה.
חלון חדש יופיע. בחרו אחת מהתמונות. בחר בכרטיסיה ניתוח בחלון המוקפץ.
בחר ספירת תאים של ניתוח סלולרי ולחץ על אישור. בטלו את הבחירה בערוצים RFP ו-Bright Field. סמן את התיבה סמן אובייקטים. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט.
התאם את סף הגודל והעוצמה כך שיכלול את כל הגרעינים, אך אל תכלול לכלוך, ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על החל שינויים בפינה הימנית התחתונה כדי להחיל את ההגדרות על כל התמונות. באופן דומה, בחר תמונה סופית היטב עם כמות בינונית עד גבוהה של הסתיידות. כדי לכוונן בצורה הטובה ביותר את יחס האות לרעש, לחץ על הכרטיסיה ניתוח בתפריט משימה.
בחר סטטיסטיקת תמונות. בטלו את הבחירה בערוץ DAPI ובערוץ שדה בהיר. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט.
סמן את התיבה חריגות סף. כדי להגדיר את ערך הסף הלא סובייקטיבי עבור האות מעל הרקע, בחר בכלי קו משורת המשימות. חלון יופיע.
צייר קו דרך טלאי של אות תוך הכללת אזור ברקע. התאם את ערכי הסף העליונים והתחתונים. ספרו רק את האות מעל הרקע ואל תכלול אם יש פסולת או חפצים.
לחץ על אישור והחל שינויים כדי להעביר את ההגדרות לכל הבארות האחרות. ודא כי הסף נבחר במדויק בבארות האחרות. לאחר הגדרת ספירת התאים וסף ה- RFP, יצא את הנתונים.
לחץ על לחצן Excel לצד התפריט הנפתח כדי לייצא את הנתונים ישירות לגיליון אלקטרוני. שלבי הסתיידות שונים, הנעים בין נמוך לגבוה, אותרו ונותחו. ההסתיידות זוהתה ככתמים שחורים באמצעות מיקרוסקופיית אור, שהיו שימושיים להערכה ראשונית ולקביעת מתי להתחיל בהדמיה.
לקבלת יחס אות לרעש משופר, תמונות ה-RFP המעובדות נותחו כדי לכמת את ההסתיידות. הנתונים התקבלו על ידי השוואת שני תנאים או יותר באותה נקודת זמן. הנתונים נורמלו לספירת תאים כאזור הסתיידות לכל תא.
הנתונים תוארו גם כסדרת זמן המציגה את אותו מצב בנקודות זמן שונות. חשוב שהתוצאות לאחר צמצום וניתוח הנתונים עדיין ישקפו את מה שניתן לראות לפני שינוי התמונה וסף.
