פרוטוקול זה נחוץ כדי להעריך את התפקידים השונים של יסודות ביוכימיים מוגדרים בגרעין ובציטופלסמה ולנתח אינטראקציות תוך-תאיות בין תחומים אלה בתוך שורות תאים שונות. טכניקה זו משתמשת בציוד מעבדה שגרתי וריאגנטים כדי להפריד בצורה יעילה יותר את השברים הציטופלזמיים והגרעיניים. פרוטוקול זה יכול לעשות זאת בזול יותר ומהר יותר מפרוטוקולים אחרים.
ככל שמחקרים על אינטראקציות ציטופלזמיות וגרעיניות הופכים נפוצים יותר, ההשפעה של לוקליזציה על אירועים תוך תאיים יכולה להיות מובנת טוב יותר. ניתן לנתח את חילופי הדברים בין הציטופלסמה לגרעין, ולציין אם מולקולות מסוימות במהלך חילופי דברים אלה יכולות להוביל להתפתחות סרטן, כפי שציינו מחקרים על חלבונים גרעיניים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין.
מכיוון שהשימוש בחיץ ליזיס תלוי במידה רבה בהפרעה של קרום התא ויש גרסאות טבעיות ביעילות של חיץ ליזה על קווי תאים שונים. כדי להתחיל, גלולה את התאים, באמצעות צינורות 1.5 מיליליטר באמצעות צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 2000 G.להשליך את supernatant באמצעות פיפטה שאיפה. להשהות את הגלולה ב 300 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר כקרח.
לאחר מכן, סובב את הצינורות במהירות של כ -12, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש. הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני.
לאחר מכן, להוסיף 500 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לגלולה וצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי לאשר את הפרדת התאים באמצעות qPCR, ראשית, להמיר את הרנ"א לדנ"א משלים באמצעות ערכה זמינה מסחרית. הכינו תערובת מאסטר של תעתיק הפוך.
הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler. המשך לביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותי וניתוח.
התחל עם דילול סינתזת cDNA עם מי DEPC כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר. באמצעות תערובת מאסטר PCR, להכין את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות. לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני.
השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי. חשב את נפח כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב בשלושה עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד. עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכשו את החלק הגרעיני המעורבב עם MALAT1, חלק ציטופלזמי עם MALAT1, שבר גרעיני עם TUG1 ושבר ציטופלזמי עם TUG1.
מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית. כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 כפול G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות תוכנת תכנון וניתוח, בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור.
באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדרת הפעלה. בדף מאפייני קובץ הנתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט. לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר את כרטיסיית הצלחת והזן את הדגימות להפעלה.
בחר התחל הפעלה. לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות. התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני.
החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1. המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הציטופלזמי. החסרו את השבר הגרעיני MALAT1 מהשבר הציטופלזמי MALAT1 ולאחר מכן חשבו את השניים שהועלו לדלתא CQ שלילי. בצע את החישובים באמצעות דוגמאות TUG1.
כאשר TUG1 נוכח כבקרה חיובית עבור יסודות ציטופלזמיים, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני. תוצאה שלילית שבה רמות של שבר ציטופלזמי נצפים במדגם עם MALAT1. הדבר מצביע על זיהום של RNA שבודד מהחלק הגרעיני, אולי בגלל ריכוזי ליזה נמוכים מדי או גבוהים מדי.
MALAT1 ו- TUG1 הציגו את המתאם הגבוה ביותר עם הפרדה גרעינית וציטופלזמית כפי שאושר באמצעות אלקטרופורזה של כתם מערבי ו- RNA, שאישרו את טוהר ואיכות הדגימות. בנוסף, ניתן להדגים את טוהר התמציות הגרעיניות והציטופלזמיות על ידי כתם מערבי המשתמש בלמין כסמן לשבר גרעיני ובאלפא-טובולין כסמן חיובי למקטע הציטופלזמי. לא נצפה שיא באלקטרופורזה של הרנ"א הציטופלזמי, מה שמדגים איכות גבוהה וזיהום מועט או ללא זיהום כלל בדגימת הרנ"א הציטופלזמי.
השימוש במאגר ליזה הוא קריטי לשבירה נכונה ואופטימיזציה של ריכוז חיץ הליזיס לקו העניין הרצוי של התא היא חיונית. טכניקה זו מאפשרת מחקר ממוקד של אינטראקציה גרעינית וציטופלזמית, אשר ישימה באופן נרחב למגוון נושאי מחקר ומאפשרת הבנה טובה יותר של האופן שבו לוקליזציה של אלמנטים ביולוגיים ספציפיים עשויה להיות קשורה לתפקודם.
