Bu protokol, tanımlanmış biyokimyasal elementlerin çekirdek ve sitoplazmadaki farklı rollerini değerlendirmek ve bu alanlar arasındaki hücre içi etkileşimleri çeşitli hücre hatları içinde analiz etmek için gereklidir. Bu teknik, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları daha verimli bir şekilde ayırmak için yaygın laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanır. Bu protokol bunu diğer protokollerden daha ucuz ve daha hızlı yapabilir.
Sitoplazmik ve nükleer etkileşimler üzerine yapılan çalışmalar yaygınlaştıkça, lokalizasyonun hücre içi olaylar üzerindeki etkisi daha iyi anlaşılabilir. Sitoplazma ve çekirdek arasındaki değişim, nükleer proteinler üzerine yapılan çalışmaların gösterdiği gibi, bu değişimler sırasında belirli moleküllerin kanser gelişimine yol açıp açamayacağını gösteren analiz edilebilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu uygun bir konsantrasyona değiştirmektir.
Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı olduğundan ve lizis tamponunun farklı hücre hatları üzerindeki etkinliğinde doğal varyantlar vardır. Başlamak için, 2000 G.'de beş dakika boyunca santrifüjleme yoluyla 1.5 mililitrelik tüpler kullanarak hücreleri pelet edin G.Emper aspire edici bir pipet kullanarak süpernatantı atın. Peleti 300 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın.
Ardından, tüpleri iki dakika boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 12.000 G hızında döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kalan pelet nükleer fraksiyon olacaktır.
Daha sonra, pelete 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın. qPCR kullanarak bölmelerin ayrılmasını doğrulamak için, önce RNA'yı ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak tamamlayıcı DNA'ya dönüştürün. Ters transkriptaz ana karışımını hazırlayın.
Şablon RNA ekleyin. Bir termosiklustaki reaksiyonları inkübe edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve analizi yapmak için devam edin.
Mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona sahip olmak için cDNA sentezini DEPC suyuyla seyreltmekle başlayın. Bir PCR ana karışımı kullanarak, manuel talimatları kullanarak her numune için reaksiyonu hazırlayın. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonasyonu tespit etmek için gerekli ticari probları edinin.
Nükleer belirteç olarak MALAT1 ve sitoplazmik belirteç olarak TUG1 kullanın. Her bir numune için teknik çoğaltmaların her biri için her bir bileşeni üçle çarparak her bileşenin hacmini hesaplayın. Her nükleer ve sitoplazmik numune için, MALAT1 ile nükleer fraksiyon, MALAT1 ile sitoplazmik fraksiyon, TUG1 ile nükleer fraksiyon ve TUG1 ile sitoplazmik fraksiyon karışımlarını elde edin.
Çözeltileri karıştırmak ve karışımın 20 mikrolitresini optik reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için kısaca vorteks. Plakayı qPCR için kullanılan şeffaf bir yapışkan filmle örtün ve hava kabarcıklarını gidermek için plakayı kısa bir süre santrifüj edin ve ardından numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Tasarım ve analiz yazılımını kullanarak, döngü parametreleri için standart eğriyi seçin.
qPCR yazılımını kullanarak kurulum çalıştır'ı seçin. Veri dosyası özellikleri sayfasında, yöntem ve giriş döngüsü parametrelerini seçin. Döngü parametrelerini girdikten sonra, plaka sekmesini seçin ve çalıştırılacak örnekleri girin.
Çalıştırmayı başlat'ı seçin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, örnek adı, hedef adı ve niceleme döngüsünü içeren bir veri elektronik tablosu oluşturun. Nükleer fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleri ile başlayın.
MALAT1 sitoplazmik fraksiyonunu MALAT1 nükleer fraksiyonundan çıkarın. Sitoplazmik fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleriyle devam edin. MALAT1 nükleer fraksiyonunu MALAT1 sitoplazmik fraksiyonundan çıkarın ve ardından negatif delta CQ'ya yükseltilmiş ikisini hesaplayın. TUG1 numuneleri ile hesaplamaları gerçekleştirin.
TUG1, sitoplazmik elementler için pozitif bir kontrol olarak mevcut olduğunda, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir. MALAT1'li numunede sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin gözlendiği negatif bir sonuç. Bu, nükleer fraksiyondan izole edilen RNA'nın, potansiyel olarak çok düşük veya çok yüksek olan lizis konsantrasyonları nedeniyle kontaminasyonunu gösterir.
MALAT1 ve TUG1, örneklerin saflığını ve kalitesini doğrulayan bir Batı lekesi ve RNA elektroforezi ile doğrulandığı gibi nükleer ve sitoplazmik ayırma ile en yüksek korelasyonu sergiledi. Ek olarak, nükleer ve sitoplazmik ekstraktların saflığı, nükleer fraksiyon için bir belirteç olarak lamin ve sitoplazmik fraksiyon için pozitif bir belirteç olarak alfa-tübülin kullanan bir Batı lekesi ile gösterilebilir. Sitoplazmik RNA elektroforezinde pik gözlenmedi, bu da sitoplazmik RNA örneğinde yüksek kalite ve çok az veya hiç kontaminasyon göstermedi.
Lizis tamponunun kullanımı, uygun fraksiyonasyon için kritik öneme sahiptir ve lizis tamponu konsantrasyonunun, ilgilenilen istenen hücre hattına optimize edilmesi esastır. Bu teknik, çeşitli araştırma konularına yaygın olarak uygulanan nükleer ve sitoplazmik etkileşimin hedeflenen çalışmasına izin verir ve belirli biyolojik elementlerin lokalizasyonunun işlevleriyle nasıl ilişkili olabileceğinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.
