Este protocolo é necessário para avaliar os diferentes papéis de elementos bioquímicos definidos no núcleo e citoplasma e para analisar as interações intracelulares entre esses domínios dentro de várias linhagens celulares. Esta técnica utiliza equipamentos de laboratório comuns e reagentes para separar de forma mais eficiente as frações citoplasmática e nuclear. Este protocolo pode fazê-lo de forma menos dispendiosa e mais rápida do que outros protocolos.
À medida que os estudos sobre interações citoplasmáticas e nucleares se tornam mais difundidos, o impacto da localização nos eventos intracelulares pode se tornar melhor compreendido. A troca entre o citoplasma e o núcleo pode ser analisada, indicando se certas moléculas durante essas trocas podem levar ao desenvolvimento do câncer, como estudos sobre proteínas nucleares indicaram. A etapa mais crítica do protocolo é modificar a concentração do tampão de lise para uma concentração adequada.
Como o uso do tampão de lise depende em grande parte da ruptura das membranas celulares e há variantes naturais na eficácia do tampão de lise em diferentes linhas celulares. Para começar, pellet as células, usando tubos de 1,5 mililitros via centrifugação por cinco minutos a 2000 G.Descartar o sobrenadante usando uma pipeta de aspiração. Ressuspeite o pellet em 300 microlitros de tampão de lise gelado.
Em seguida, gire os tubos a uma velocidade de cerca de 12.000 G a quatro graus Celsius por dois minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mililitros. O pellet restante será a fração nuclear.
Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS gelado ao pellet e centrífuga a 2000 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Para confirmar a separação dos compartimentos usando qPCR, primeiro, converta o RNA em DNA complementar usando um kit comercialmente disponível. Prepare a mixagem mestre da transcriptase reversa.
Adicione o modelo de RNA. Incubar reações em um termociclador. Prossiga para a realização de reação e análise quantitativa em cadeia da polimerase.
Comece diluindo a síntese de cDNA com água DEPC para ter uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Usando uma mistura mestra de PCR, prepare a reação para cada amostra usando instruções manuais. Adquirir sondas comerciais necessárias para detectar o fracionamento citoplasmático e nuclear.
Use MALAT1 como marcador nuclear e TUG1 como marcador citoplasmático. Calcular o volume de cada componente multiplicando cada componente por três para cada uma das repetições técnicas para a amostra individual. Para cada amostra nuclear e citoplasmática, adquirir as misturas fração nuclear com MALAT1, fração citoplasmática com MALAT1, fração nuclear com TUG1 e fração citoplasmática com TUG1.
Vórtice brevemente para misturar soluções e transferir 20 microlitros da mistura para cada poço de uma placa de reação óptica. Cubra a placa com uma película adesiva transparente utilizada para qPCR e centrifugar a placa brevemente para eliminar bolhas de ar e, em seguida, gire a amostra para baixo a 300 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Usando o software de projeto e análise, selecione a curva padrão para os parâmetros de ciclismo.
Usando o software qPCR, selecione executar configuração. Na página de propriedades do arquivo de dados, selecione os parâmetros do método e do ciclo de entrada. Depois de inserir os parâmetros do ciclo, selecione a guia da placa e insira as amostras a serem executadas.
Selecione Iniciar execução. Após a conclusão da execução, crie uma planilha de dados com o nome da amostra, o nome do destino e o ciclo de quantificação. Comece com as amostras MALAT1 para calcular a fração nuclear.
Subtraia a fração citoplasmática MALAT1 da fração nuclear MALAT1. Continue com as amostras de MALAT1 para calcular a fração citoplasmática. Subtraia a fração nuclear MALAT1 da fração citoplasmática MALAT1 e, em seguida, calcule as duas CQ delta elevadas. Execute os cálculos com amostras TUG1.
Quando o TUG1 está presente como um controle positivo para elementos citoplasmáticos, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam superiores aos níveis de fracionamento nuclear. Um resultado negativo onde os níveis de fracionamento citoplasmático são observados na amostra com MALAT1. Isso indica contaminação do RNA isolado da fração nuclear, potencialmente devido a concentrações de lise que são muito baixas ou muito altas.
MALAT1 e TUG1 apresentaram a maior correlação com a separação nuclear e citoplasmática, confirmada por meio de Western blot e eletroforese de RNA, que confirmou a pureza e a qualidade das amostras. Além disso, a pureza dos extratos nuclear e citoplasmático pode ser demonstrada por um Western blot usando lamina como marcador para fração nuclear e alfa-tubulina como marcador positivo para a fração citoplasmática. Não foi observado pico na eletroforese do RNA citoplasmático, demonstrando alta qualidade e pouca ou nenhuma contaminação na amostra de RNA citoplasmático.
O uso do tampão de lise é fundamental para o fracionamento adequado e otimizar a concentração do tampão de lise para a linha celular desejada de interesse é essencial. Esta técnica permite o estudo direcionado da interação nuclear e citoplasmática, que é amplamente aplicável a uma variedade de tópicos de pesquisa e permite uma melhor compreensão de como a localização de elementos biológicos específicos pode se correlacionar com sua função.
