בניגוד למסלולים מטבוליים אחרים כמו סילוק גלוקוז, סינתזת חומצות שומן אינה מוערכת באופן שגרתי, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שהיא יחסית לא פולשנית, וסביר להניח שהיא משקפת טוב יותר את שטף סינתזת חומצות השומן מאשר שימוש בגלוקוז המסומן באיזוטופים, שבו שינויים בטיפול בגלוקוז במעלה הזרם יכולים להשפיע על התוצאות. כאן, אנו מתמקדים ברקמת שומן חומה, אך שיטה זו עשויה להיות שימושית לחקר כל רקמה בכל מודל עכבר.
כדי להתחיל, הניחו את הדגימות על קרח יבש. קחו צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש, הניחו אותו על איזון אנליטי וטפחו על האיזון. לאחר מכן הניחו פינצטה ואזמל או סכין גילוח מפלדה על קרח יבש למשך 10 עד 20 שניות להתקרר.
השתמשו בפינצטה כדי להוציא את דגימת הרקמה הקפואה מהצינור והניחו אותה על סירת משקל מפלסטיק, אותה ניתן למקם על גוש שטוח של קרח יבש או משטח אחר מקורר מראש. באמצעות אזמל או סכין גילוח פלדה, לנתח חלק קטן של הרקמה שווה ערך 5 עד 15 מיליגרם במשקל, ומניחים אותו בתוך צינור microcentrifuge. רשום את המשקל המדויק וחזור על הפעולה עבור כל דגימה.
הוסף מיקרוליטר אחד למיליגרם של 10 מילימולרית חומצה הקסדקאנואית D31, ואחריו שלושה חרוזי נירוסטה חמישה מ"מ לכל דגימה. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר מתנול, 250 מיקרוליטר מים ו-500 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה עם חרוזים. מניחים את הצינורות בגוש מקורר מראש של טחנת טחינה ומערבבים את הדגימות בתדר רטט של 25 הרץ במשך חמש דקות.
הסר את החרוזים באמצעות מגנט וצנטריפוגה את הדגימות ב 12, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרופיפטה, לקחת נפח קבוע של השלב התחתון של כל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge מסומן בהתאם. הוסף 500 מיקרוליטר כלורופורם לדגימה הנותרת וחזור על שלבים אלה.
הניחו את הצינורות עם הפאזה התחתונה המשולבת תחת גז חנקן או בוואקום צנטריפוגלי מקורר עמיד לכלורופורם בארבע מעלות צלזיוס עד לייבוש מוחלט. פיפטה 98 מיליליטר מתנול נטול מים לתוך בקבוק מדיה זכוכית. ולהוסיף לאט שני מיליליטר של חומצה גופרתית נטולת מים במכסה האדים כדי לייצר 2% חומצה גופרתית מתנול.
מערבבים על ידי ערבול הבקבוק הסגור. הוסף 500 מיקרוליטר של חומצה גופרתית זו 2% בתמיסת מתנול לכל דגימה ומערבולת לזמן קצר. לדגור את הדגימות על בלוק החום ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולהוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי רווי ו 500 מיקרוליטר של הקסאן לכל דגימה.
מערבבים את הדגימות במרץ בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת ומשאירים את הדגימות לשבת דקה אחת. שני השלבים צריכים להיות ברורים לאחר מכן. אספו את השלב העליון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
לאחר מכן חזור על תוספת הקסאן. ולאחר הפרדת פאזה, לאסוף את דגימות השלב העליון השני לתוך אותן צינורות מסומנים. יבשו את הדגימות בטמפרטורת החדר תחת גז חנקן והשהו מחדש את הדגימות ב-20 מיקרוליטר הקסאן למיליגרם ממשקל הרקמה המקורי.
מעבירים את הדגימות מיד לבקבוקון כרומטוגרפיית גז זכוכית עם תוספת זכוכית. הזריקו את הדגימות לתוך ספקטרומטר מסות כרומטוגרפיית גז מרובע יחיד כדי לקבוע את שפע אסטרי המתיל של חומצות שומן או איזוטופולוגים של FAME. הזריקו מיקרוליטר אחד של דגימה לכניסה מפוצלת או מפוצלת בטמפרטורת כניסה של 270 מעלות צלזיוס באמצעות הליום כגז המוביל.
בצינורות מיקרוצנטריפוגות עם נעילה בטוחה, יש לשלב 10 מיקרוליטר מכל דגימת פלזמה או ארבעה מיקרוליטרים סטנדרטיים של 10 נתרן הידרוקסידי מולארי וארבעה מיקרוליטרים של 5% אצטון באצטוניטריל. בצע זאת בשלשה עבור כל דגימה. לאחר הדגירה על הדגימות במשך הלילה בטמפרטורת החדר, מוסיפים 450 עד 550 מיליגרם נתרן גופרתי לכל דגימה, מוסיפים 600 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור במכסה האדים, ומערבלים במרץ במשך 15 שניות.
צנטריפוגה את הדגימות ב 300 G במשך שתי דקות. קח בקבוקוני GCMS זכוכית מסומנים עם תוספות זכוכית ולהעביר את הטריפליקט ולאחר מכן 80 מיקרוליטר aliquots של supernatant מכל דגימה לבקבוקונים. מכסים את הבקבוקונים בחוזקה לניתוח GCMS.
אחוז העשרת D2O בפלזמה של עכברים על פני נקודות זמן מרובות מוצג כאן. נמצא כי מי הגוף מועשרים בטווח של 2.5 עד 6%, כי רמה בסיסית של העשרת דאוטריום במי הגוף מושגת במהירות תוך שעה אחת ונשמרת למשך המחקר. התפלגות איזוטופולוג המסה של פלמיטט ברקמת שומן חום לאחר שלושה ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-נייטרליות מוצגת כאן.
תוצאה זו מראה העשרה גבוהה יותר של M1 ו-M2 בדאוטריום בטמפרטורת החדר. באיור זה מוצגים העשרה מולרית של רקמת שומן חומה והעשרה מולרית פלזמה של מגוון חומצות שומן לאחר שלושה ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-ניטרליות. העשרת הטמפרטורה הקרה יותר נמצאה במגוון רחב של חומצות שומן ברקמת השומן החומה.
יש לציין כי העשרת חומצות השומן הכוללת בפלזמה אינה עוקבת אחר אותה מגמה כמו רקמת שומן חומה, אלא במקום זאת, העשרת חומצות שומן מוגברת עם ניטרליות תרמית. תמונות אלה מייצגות את השפע הכולל ואת הפלמיטט המסונתז דה נובו ברקמת שומן חומה לאחר שלושה ימים של מתן D2O. התוצאה מראה עלייה בסינתזה הכוללת של פלמיטט בטמפרטורת החדר.
היזהר בעת הפעלת חומצות שומן על GCMS. יש לוודא שהפלמיטט אינו עמוס יתר על המידה, שכן הוא רק יכול לתת ערכי העשרת איזוטופים גבוהים באופן מלאכותי. בנוסף, בעת ניתוח אצטון ב- GCMS, ודא שאין שיא אצטון ברקע לפני הפעלת הדגימות, לכן הפעל ריקים כדי להסיר אצטון כלשהו במערכת.
שיטה זו בוחנת את סך חומצות השומן על פני קבוצות שומנים מרובות, אך אם ברצונך להבין כיצד סינתזת חומצות שומן משפיעה על קבוצות שומנים ספציפיות, תחילה תוכל להפריד בין מחלקות שומנים אלה באמצעות כרומטוגרפיה ולאחר מכן לחלץ חומצות שומן משברים אלה. מכיוון שליפוגנזה היא תורמת מרכזית להתפתחות תקינה, אך גם למחלות רבות, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי בתחומים רבים.
