פרוטוקול זה מספק סימוכין אמינים להכנת תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה ממעי אמנון הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגים בחקלאות ימית. הטכנולוגיה יעילה ביותר וניתנת ליישום ברוב תנאי המעבדה. זה מפחית את הצורך בניסויים נוספים כדי להכין תרחיפים חד-תאיים עבור מיני דגים של חקלאות ימית.
התחילו בשטיפת דגי אמנון הנילוס בני שישה חודשים במים סטריליים מאווררים היטב למשך 15 דקות כדי לשטוף חיידקים הקשורים באופן רופף מפני השטח. להכנת מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התא, יש לדלל את ה-collagenase dispase ב-PBS לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. מערבבים 95% נפח של תמיסה אנזימטית מוכנה ונפח 5% של FBS.
לאחר מכן קיררו מראש את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. לדיסקציה של רקמות, הניחו את הדג המרדים על קרח ואספו שלושה עד ארבעה סנטימטרים מאמצע המעיים. הבלו את השומן ואת mesentery באמצעות מלקחיים.
הסר את השומן המחובר לפני השטח של המעי ואת הרירית השקופה האלסטית והגמישה. שטפו בעדינות את קטע המעי עם PBS סטרילי קר כקרח באמצעות מזרק כדי לשטוף את תוכן המעי ואת הריר. לאחר מספר שטיפות, מנתחים את השבר לחתיכות קטנות ומעבירים אותם לצינור 1.5 מיליליטר המכיל PBS קר כקרח של מיליליטר אחד.
צנטריפוגה את התערובת ב 300 x גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. והחלף את הסופרנאטנט במיליליטר אחד קר כקרח 0.08% BSA-DPBS. בעזרת פיפטה מזכוכית שואפים בעדינות להשהות מחדש את שברי הרקמות.
לאחר שטיפת החתיכות פעם נוספת, להסיר את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה אנזימטית מוכן. כמו כן מערבבים חמישה מיקרוליטרים של מעכב RNA עם מגיב הדיסוציאציה לריצוף RNA חד-תאי. הניחו את הצינור באמבט מים מחוסמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והפכו את הצינור ידנית כל חמש דקות במהלך זמן הדגירה של 30 עד 60 דקות.
לאחר סיבוב הצינורות, הסר את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התאים באמצעות קצוות רחבים. הוסיפו מיליליטר אחד של BSA-DPBS קר כקרח 0.08% והוסיפו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי למנוע הפרעה לתאים. לאחר צנטריפויה והשעיה מחדש של התאים פעם נוספת, הניחו את מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר שהורטבה מראש עם 0.08% BSA-DPBS על צינור חרוטי של 50 מיליליטר.
מעבירים את מתלה התא דרך המסננת. הקש על המסננת, ולאחר מכן שטוף אותה עם DPBS של 200 מיקרוליטר ואסוף את התרחיף בתחתית הצינור. לאחר העברת התרחיף לתוך צינור 1.5 מיליליטר, להוסיף חמישה מיקרוליטר של DNA לדגור את התרחיף במשך 15 דקות ב 15 עד 20 מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 400 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח ללא יוני סידן ומגנזיום. לאחר מכן פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם קצוות רחבים כדי לערבב את התאים ולחזור על תהליך זה פעם נוספת. להכתמה, מערבבים את תרחיף התא בתמיסה כחולה טריפאן 0.4% ביחס שווה ודגרים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר מהתערובת על שקופית הזכוכית. ספרו את התאים החיים והמתים תחת המיקרוסקופ בשלושה שדות וחשבו את אחוז הכדאיות של התא. הושוותה יעילות הדיסוציאציה של מספר אנזימים נפוצים.
תערובת collagenase dispase אומתה כבעלת אפקט דיסוציאציה טוב יותר מאשר collagenase dispase או טריפסין לבדם וכמה תערובות אנזימים אחרות. הבדיקה המיקרוסקופית הראתה כי תאי המעי היו בעלי כדאיות גבוהה והתפזרו כתאים בודדים. רוב התאים היו בני קיימא, בעוד שמעטים הוכתמו מתים בגלל קרום התא החדיר.
שימו לב לסוג PBS בשימוש. לא ניתן להשתמש בתמיסת עיכול אנזימטית עם PBS נטול סידן/מגנזיום מכיוון שהאנזים דורש יוני סידן/מגנזיום כדי לתפקד ביעילות. ההליך מאפשר מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית, ומספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים של מיני דגים בחקלאות ימית.
