הכנת תא יחיד או השעיית גרעינים בודדים היא צעד קריטי לתמלול תפוקה גבוהה ופרופיל אפיגניום. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה, ניתנת לשחזור ואוניברסלית לבידוד גרעיני יחיד. בניגוד לשיטות אחרות הדורשות חומר ניקוי לבידוד גרעינים, הפרוטוקול שלנו מבוסס עמודה, שהוא נטול חומרי ניקוי ואנזימים.
זה מאפשר בידוד גרעיני בפחות מ -30 דקות. הפרוטוקול שלנו מפשט את בידוד הגרעינים. הוא מספק שיטה חזקה להכנת השעיית גרעינים יחידה מרקמות קשות לניתוק.
כדי להתחיל, חיץ טרום צמרמורת A ו- B מערכת בידוד גרעינים ללא חומר ניקוי על ידי הנחתם על קרח לפחות 30 דקות. צינורות מעיל וטיפים פיפטה עם 5%BSA פתרון, אשר ישפר את ההתאוששות של הגרעינים. כדי לצפות את הטיפים פיפטה, פיפטה 5%BSA פתרון פעמיים עד שלוש פעמים אוויר לייבש אותם במשך שעתיים.
כדי לצפות את הצינורות, למלא אותם עם BSA ולהפוך אותם שלוש פעמים. הסר את הפתרון ואת האוויר לייבש את הצינורות במהופך על נייר טישו נקי במשך שעתיים. מעיל צינור איסוף אחד וצינור אחד 1.5 מיליליטר לכל מדגם.
השתמש במקלפים כדי לשבור בעדינות את הגולגולת ולהסיר רקמות רכות, עור ועצמות מהצדדים הגחוני והדורסי של הגולגולת. לאחר מכן מעבירים בעדינות את המוח לצלחת של 30 מילימטר המכילה PBS קר כקרח וטחון את המוח לחתיכות קטנות באמצעות סכין גילוח. כדי לבודד גרעינים בודדים, להעביר את הרקמה הטחונים למחסנית המסנן המסופקת בערכת בידוד הגרעינים ולהסיר פתרון עודף ולהוסיף 200 microliters של חיץ קר A.Grind את הרקמה עם מוט פלסטיק במשך שתי דקות.
הוסף 300 מיקרוליטרים של חיץ קר A למחסנית המסנן והדגירה אותו על קרח עם הכובע פתוח במשך 10 דקות. ואז לכסות את המחסנית ולתלות מחדש את הרקמה על ידי היפוך הצינור חמש פעמים. צנטריפוגה צינור המדגם ב 16, 000 פעמים g במשך 30 שניות כדי לקרוע את התאים.
הזרימה-דרך מכיל גרעינים שלמים, אשר יוצרים גלולה חסרת צבע בתחתית הצינור. השלך את המסנן ולאחר מכן בצע שימוש חוזר בכדור על ידי מערבולת נמרצת במשך 10 שניות. גלולה הגרעינים שוב על ידי צנטריפוגה הפתרון ב 500 פעמים g במשך שלוש דקות.
ואז בזהירות להשליך את העל-טבעי. Resuspend את גלולה ב 0.8 מיליליטר של חיץ קר B על ידי צינורות פעמיים עד שלוש פעמים צנטריפוגה הגרעינים ב 600 פעמים g במשך 10 דקות, אשר יפריד אותם פסולת קרום. השלך בזהירות את העל-טבעי.
תחוו מחדש את הגרעינים המבודדים ב-500 מיקרוליטרים של PBS עם 5%BSA ושמור את המתלים על הקרח עד FACS. כדי לאשר מורפולוגיה גרעינית עם כתמי HEX, להעביר 100 microliters של ההשעיה גרעיני יחיד צינור חדש באמצעות טיפים מצופים BSA. הכתם את הגרעינים על ידי הוספת 0.1 מיקרוליטר של HEX ומערבולת בעדינות את הצינור.
מעבירים את ההשעיה הגרעינית לצלחת תחתונה מזכוכית ולתמונה של הגרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדרת עירור לייזר של 405 ננומטר. לפני ביצוע FACS, לסנן את הגרעינים עם מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור מצופה BSA. לדלל את ההשעיה מסוננת על ידי הוספת PBS עם 5%BSA לנפח סופי של 1,000 microliters.
סמן שתי צינורות FACS תחתונים עגולים כפקדים ומוכתמים והעבר 250 מיקרוליטרים של מתלי הגרעינים לתוך צינור הבקרה באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA. העבר את 750 המיקרוליטרים הנותרים של הפתרון לצינור FACS המסומנים מוכתמים והוסף מיקרוליטר אחד של צבע HEX כדי להכתים את הגרעינים. ואז לערבב אותו על ידי מערבולת איטית.
טען את דוגמת הפקד הלא נגועה לתוך סדרן התאים והרשים 5,000 אירועים. לאחר מכן טען את המדגם המוכתם והקליט 5,000 אירועים. צייר שערי FACS לזיהוי גרעיני יחיד.
ניתן לבחור בגרעין על ידי השוואת אות הפלואורסצנטי HEX בין הבקרה לדגימות מוכתמות. לאחר מכן מיין את הגרעינים החיוביים HEX מהצינור המוכתם לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 50 מיקרוליטרים של PBS עם 5%BSA. פרוטוקול זה שימש ליצירת השעיית גרעין יחיד ישירות מרקמה מוחית של דגי זברה.
הגרעינים המבודדים היו מוכתמים ב- HEX והודמיו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הם נראו שלמים, עגולים ומופרדים היטב. חשוב לציין, צבירה גרעינית נעדרה.
העשרה של גרעינים מבודדים בוצעה עם ציטומטריית זרימה על ידי gating על נוכחותו של אות פלואורסצנטי HEX. גרעינים לא מזוהמים הציגו פלואורסצנטיות ברקע בעוד גרעינים מוכתמים הפגינו אות פלואורסצנטי חזק. הגרעינים הבלתי מוכתמים והוכתמים היו מופרדים היטב בערוץ הסגול.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי גרעיני יחיד נוטה להידבק על חומר פלסטי. כדי למנוע אובדן פוטנציאלי של גרעינים ולהגדיל את היעילות, ציפוי בסיסי של חומר פלסטי מומלץ מאוד. השעיית גרעינים בודדת יכולה להיות מנוצלת עוד יותר עבור RNA גרעיני יחיד טכניקה זו מבהיר הטרוגניות תאית במערכות ביולוגיות מורכבות ומסייעת להגדיר תת-סוגים של תאים ורשתות גנים.
שימוש בשיטה נטולת חומרי ניקוי ואנזימים רושם את הרעש הטכני ואת ההטיה שהוצגו במהלך הכנת הדגימה. שיטה זו פיתחה בידוד גרעין יחיד פשוט ותיאיסטי.
