בכלי דם, מספר תאי האנדותל נמוך מאוד, מה שמקשה על חקירתם. הפרוטוקול שלנו מבטל את המגבלה הזו, ומאפשר לנו לחקור מסלולים מולקולריים וטיפולים חדשניים. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לקבל דגימות מועשרות באנדותל, ולחקור כיצד זרימה מופרעת חריפה וכרונית משפיעה על סוג תא זה.
היכולת לחקור תאי אנדותל בפירוט רב יותר מאפשרת להגדיר גני מטרה, ולכן טיפולים פוטנציאליים לטרשת עורקים המכוונים לתאי אנדותל. בידוד עורקי הצוואר הוא מסובך, ודורש סבלנות וניסיון. כדי להתחיל, להכין את החיה על ידי הזרקת 0.05 מיליגרם לק"ג של buprenorphine תת עורית.
לעקר את האזור האפילציה באמצעות תמיסת בטאדין ואיזופרופנול שלוש פעמים. בצע חתך בקו האמצע הגחוני של כסנטימטר אחד באזור הצוואר. לאחר מכן חשוף את נקודת ההסתעפות של LCA על ידי דיסקציה קהה.
Ligate את הצוואר הפנימי השמאלי, הצוואר החיצוני, ואת העורקים העורפיים עם 6-0 תפרים, משאיר את עורק בלוטת התריס העליון ללא מגע. סגור את החתך עם דבק רקמות או תפרים. העבירו את העכבר לכלוב התאוששות שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הניחו את העכבר על מגבת נקייה למשך עד שעה כדי למנוע היפותרמיה לאחר הניתוח. יש להחדיר מחט בעלת 21 מד לקו האינפוזיה המחובר דרך קצה הלב לחדר השמאלי. יש לאפשר זלוף מדרדר למשך 2-3 דקות באמצעות תמיסת מלח רגילה בטמפרטורת החדר.
שמרו על קצב זרימה קבוע על ידי הפעלת לחץ קבוע בזמן הזרקה או שימוש בקו IV, ושמירה על שקית המלח בגובה של שמונה עד תשעה מטרים. הסר את העור מאזור הצוואר עם כל השומן, השרירים ורקמות החיבור כדי לחשוף את עורקי הצוואר. לאחר מכן להסיר את הרקמות periadventitial סביב הקרוטידים משאיר את הקרוטיד מחובר לגוף.
בצע חתך מתחת לאתר הקשירה ב- LCA כדי לאפשר זילוף. יש למזג את ה-LCA דרך החדר השמאלי למשך דקה נוספת כדי להסיר עקבות דם. לשטוף את החלק החיצוני של עורקי הצוואר עם תמיסת מלח רגילה כדי להסיר כל עקבות של דם.
השתמש מזרק אינסולין עם מחט 29 מד כדי להזריק 50 microliters של חיץ העיכול לתוך לומן של הקצה הדיסטלי של עורק הצוואר השמאלי. השתמש בתפס מיקרו כדי להדק את הקצה הפרוקסימלי של עורק הצוואר המלא בחיץ עיכול. הוסיפו 15 עד 20 מיקרוליטרים של חיץ עיכול ללומן, וחתכו את הקצה הדיסטלי כדי למנוע שחרור של חיץ עיכול.
מעבירים את עורקי הצוואר מהעכבר לכלים של 35 מילימטרים המכילים תמיסת מלח חמה של 37 מעלות צלזיוס HEPES. ולדגור אותם במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה לסירוגין. הסר את עורק הצוואר עם מלחציים מן צלחת 35 מ"מ לאחר עיכול אנזימטי לומינלי הושלמה.
נתק את המהדקים בזהירות, כך שמאגר העיכול לא ידלוף. החזיקו קצה אחד של עורק הצוואר על גבי צינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ עיכול חם לומן על ידי החדרת מחט 29 מד מצויד מזרק אינסולין.
לשטוף במהירות את לומן של עורק הצוואר בצינור צנטריפוגה מיקרו, ולאחר מכן להוסיף 0.3 microliters של FBS לתוך הצינור כדי לעצור את התגובה. הניחו את צינור הצנטריפוגה הזעיר על קרח. צנטריפוגה התאים ב 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות צנטריפוגה מצויד רוטור זווית קבועה להשליך את supernatant.
להשעות מחדש את התאים במאגר העיכול, המכיל מגיב דיסוציאציה של תאים, ולדגור אותם במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפריד אותם לתאים בודדים. לחסום את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 0.15 מיליליטר של FBS לצינור 0.5 מיליליטר, ולחזור על הצנטריפוגה. השליכו את הסופר-נטנט, והניחו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת 1%BSA קרה כקרח ב-PBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.2 מיליליטר.
לניתוח תאים בודדים, יש להשהות את הכדור עם 100 מיקרוליטר של 1%BSA קר כקרח ב-PBS בצינור של 0.2 מיליליטר. לניתוח גרעין יחיד, יש להשעות את כדור התא ב-100 מיקרוליטרים של 0.04% BSA ב-PBS קר כקרח, ולבצע צנטריפוגה של תרחיף התא הבודד ב-500G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מפרקים את תרחיף התא הבודד עם חיץ ליזיס קר כקרח, ודוגרים במשך חמש דקות על קרח.
מערבבים את הליזאט עם פיפטה P20, ודוגרים עוד 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את ליזאט בצינור 0.5 מיליליטר. לשטוף את התאים ly עם 500 microliters של חיץ, ומערבבים אותם באמצעות פיפטה.
לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה. השליכו את הסופר-נטנט, והחזירו את כדור הגרעינים ב-150 מיקרוליטרים של מאגר הגרעינים המדולל. לספור את ההכנות גרעינים בודדים באמצעות hemocytometer.
בעקבות מחקר ריצוף גרעינים בודדים, תאים בודדים וגרעינים בודדים התקבלו והודגמו על ידי מיקרוסקופיה של שדה בהיר וניגודיות פאזה. כמו כן הודגמה היעילות של הכנת גרעינים בודדים מתלייה של תא בודד. לאחר מחקר ריצוף הרנ"א של התא הבודד, התקבלו פרמטרים שונים כגון התפלגות גנים לכל תא, מזהה מולקולרי ייחודי לכל תא, קריאות מיטוכונדריאליות לכל תא ונתוני רוויית ריצוף.
עבור מחקר רצף ATAC של תא בודד, נצפתה התפלגות גודל התוספת, כולל תבנית הפסים של הנוקלאוזום. כמו כן נצפה ציון העשרת TSS המנורמל. בנוסף, קטע האחוזים קורא בפסגות.
נקבעו שברי אזורי שיא, ציון העשרת TSS, יחס הקריאות באתרים הגנומיים ברשימה השחורה ויחס אות נוקלאוזום. העיכול האנזימטי מהווה לחץ עבור התאים, ולכן חיוני לשמור על הדגימות על הקרח, ולבצע את ההליך מהר ככל האפשר. אנו יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להשיג ולצבוע תאי אנדותל מעכברים.
אנו יכולים גם להשתמש בטכניקה זו כדי לבצע מחקרים מבוססי Omix בתפזורת. טכניקה זו סללה את הדרך לחקר ההשפעה של הפרעה בזרימת הדם על תאי אנדותל in vivo באופן חד-תאי.
