עבודה זו נתמכה על ידי DoD גרנט PT074620 (SLJ) ו-NIH גרנט R01NS245014 (SLJ).

1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי Matrigel קפוא על קרח רטוב, ומשאיר מספיק זמן לפני הניסוי (אין להאיץ את התהליך על ידי חימום פעיל). Matrigel משמש להקים סביבת 3D הדומה תאי מטריקס תורמת הנדידה של התאים. הוא מספק תאים עם שני מצע מכני encasing. Matrigel מאוחסן קפוא ב -20 ° C. לפני השימוש, זה צריך להיות הביאה בהדרגה עד לטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס, כלומר מופשר על קרח רטוב או במקרר. Matrigel בלתי הפיך סטים כדי ליצור ג&#39;ל בטמפרטורה של הדגירה (37 ° C). לכן לא מומלץ לזרז את הפשרת ידי טבילה את המיכל במים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברים חלבון מוכנים ידי התמקדות isoelectric (IEF) של תמצית החלבון הכולל של קליפת המוח של יום הלידה 0 (P0) החמוס. לאחר ההפרדה, שברים הם dialyzed לילה נגד pH7.2 20mm טריס-HCl כדי לנקות את קטעים המרכיבים חיץ התמקדות, אשר עשוי להיות רעיל הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת חלבון המערכת. חלבונים מופק בקליפת המוח הם adsorbed על חרוזים לטקס פלורסנט אשר ואז לאט לאט לשחרר את החלבונים עד environment.We מצאו כי התכונה הקרינה מסייעת בטיפול החזותי של microspheres ומאפשר זיהוי קל של גלישת אפילו מינימלי מהאתר של חרוז ההפקדה, כאשר צפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10μl של חרוזי ניאון 100-200μl של פתרון חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות בחושך ב RT על שייקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין החרוזים מטה בצנטריפוגה ספסל עבור 1 שעות בבית מהירות מרבית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות במערבולת באמצעות 10μl של מדיום חדש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30μl של Matrigel על ההשעיה, ומערבבים היטב, ומניחים על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Buffers התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סינון לעקר מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, לאא 2 PO 4 1.2 מ&quot;מ, KCl 3.2mM, MgSO 4 1.2 מ&quot;מ, CaCl 2 2.4mM, גלוקוז 10mm). סלאש, להקפיא את aCSF מראש, כך שזה מוכן בזמן דיסקציה רקמות. כדי לעשות את זה, במקום בקבוק פלסטיק מלא aCSF סטרילי בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס. צג הקפאת כל כך הרבה פעמים, אז מתי שכבת הקרח מצטבר על הצד הפנימי של הקיר, לשבור אותו לערבב עם הנוזל. חזור על הפעולה עד הבקבוק מכיל בעיקר ברד קפוא. מאגר מוכן בדרך זו לא רק תומך הישרדות רקמות, אלא גם להחזיק בטמפרטורה נמוכה יותר, היא מכנית פחות מזיק לרקמות מאשר קוביות קרח עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני Neurobasal עם N-2 ו-B-27 תוספי הוסיף על פי הצעות של היצרן, כמו גם 1mg/100ml gentamycin, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, וגלוקוז 0.6%. לעקר על ידי סינון דרך קרום 0.22μm. להתחמם על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות צלחות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיתה תרבות פלסטיק שש צלחות מוכנים היטב על ידי מנקדים כל טוב במרכזו עם כמות קטנה (כ 2μl) של Matrigel קר באמצעות קצה 20μl פיפטה, ומיקום coverslip autoclaved עגול זכוכית 18mm על כל טיפה. גם הצלחות וגם coverslips צריכים להיות מטופלים אחרת תרבות. </li></ol></li></ol> 2. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבלת רקמת המוח <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה עמוקה החיה עם Euthasol, להסיר את המוח למקם אותו קר כקרח aCSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את ההמיספרות עם אזמל פרוסה coronally ב 500μm באמצעות מכשיר של בחירה, איסוף פרוסות לתוך צלחת קטנה ובה קר כקרח aCSF </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants ביצוע (שימוש במיקרוסקופ לנתח) <ol class="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פרוסות המכיל את יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ואזורים קיצוץ של קליפת המוח אשר עשויה תלתל על GE ו להפריע צעדים נוספים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האריס Uni-Core נשא באזור קרוב לפני השטח חדרית של GE, לחזור בו גרעין המכילה בעיקר אזור חדרית, ולגרש את זה עם הבוכנה לתוך מדיום קר כקרח (תמונה 1). שלוש עד ארבע explants של 0.5 בקוטר מ&quot;מ יכול להתבצע מן GE חד פרוסה P0 במוח החולדה. שים לב הן מכרסמים חמוסים, GES המדיאלי ו לרוחב הם התמזגו בגיל זה. אם הליבה נשארת פרוסה או תקוע לתחתית הפלסטיק של המנה, לגייס אותו באמצעות התזת aCSF עם קצה פיפטה ולהעביר עם טפטפת לתוך תבשיל המכיל בינוני Neurobasal קר. שמור את המנה על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קבוצה של explants מן המדיום תוך ירידה גדולה של קר כקרח Matrigel (כ 0.25-0.5ml) להציב צלחת נפרדת, מקפיד להיות explants שקוע לחלוטין והימנעות בועות. שמור את המנה על קרח רטוב. גודל אצווה תלוי במהירות של זרימת הזרם. </li></ol></li></ol> 3. הגדרת התרבות (שימוש במיקרוסקופ לנתח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמיד Matrigel ו Matrigel המכילים תערובות על הקרח, כדי למנוע ריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Remix ההשעיה מקום חרוז 1-2μl או פחות ההשעיה חרוז Matrigel קר כקרח במרכז coverslip כוס ממוקם בעבר צלחת תרבות היטב באמצעות קצה פיפטה 20μl. תן לזה קצת להגדיר, למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה 20μl פיפטה להרים 2 explants מירידה Matrigel ולמקם אותם באזור הרצוי של ההפקדה חרוז (לפחות 1 מ&quot;מ מהקצה הפיקדון) באופן סימטרי משני צדי. תן לו לקבוע לא יותר 5min בטמפרטורת החדר. העיתוי הנכון של צעדים B ו-C הוא קריטי. אם הזמן קצר מדי זה יוביל gelling ורכיבים חלקית של הגדרת התרבות יעברו כאשר הם מכוסים שכבה הסופי של Matrigel, אם הזמן ארוך מדי זה עלול לגרום לייבוש יתר של הג&#39;ל ויצירת מחסומים פיזיים הפגיעה תנועה חופשית של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החרוזים ואת explant בשכבה שטוחה של כ 30μl של Matrigel, להאריך אותו מעבר explants (Fig.2). תן לו לקבוע בחממה כ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml של המדיום Neurobasal עם תוספי מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% O 2 / 95 2% פעילות ניטור נודדות מדי יום. </li></ol> 4. חיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 3-4 ימים, עיין צלחות תרבות לבחור coverslips של עניין. Explants צריך ליצור ענן אחיד רדיאלית של תאים. החלף coverslips נבחר לתוך צלחת תרבות טריים אשר ישמשו בתחום ההדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו coverslips יושבים צלחת החדש במשך הלילה. לפני הצבת צלחת על המיקרוסקופ הדמיה, במנדף תרבית תאים, השתמש מרית סטרילי כדי להזיז את coverslip על מנת לשחרר את כל microbubbles שאוספות בין coverslip ואת צלחת תרבית תאים. התערבות של בועות יהרוס את התמונות. הזז את coverslips למרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אידוי, למלא את החלל בין בארות מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הצלחת ממכסה המנוע התרבות התאים במיקרוסקופ לא להעביר את coverslips ממרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ערכת הדמיה באמצעות תוכנת הדמיה. בשל אופייה 3D של הגדרת התרבות התאים גם להזיז אנכית, ולכן חשוב לאסוף Z-המטוסים המקיף עומק מלא ענן ההגירה. היקף XY האזור צילמו צריך להיות גם קבוצה גדולה מספיק כדי לכסות אזורים צפוי להיות מאוכלס על ידי תאים נודדים במהלך ההקלטה, כדי להכיל את הפיקדון חרוז כדי להקליט אוריינטציה זוויתי של explant לבין תאים נודדים יחסית מקור החלבון. כמו כן רואים כי המטוסים צילמו יותר Z, או את האזור מכוסה יותר, יותר זמן זה לוקח להקליט מחזור בנקודת זמן מסוימת, מכריח מרווחי הזמן בין דגימות עוד הפסד של רזולוציה הזמני של מעקב התא. במקרה שלנו, באמצעות המטרה 10x, את ערכת אופטימלי היה הקלטה אריח 3x3 עבור כל אחד 10 Z-המטוסים מרווחים כל 20μm, במרווחים של 30 דקות. מצאנו 30 דקות במרווחים הארוך ביותר המאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים בנקודות זמן רצופים, שהוא קריטי עבור מעקב אמין של תנועותיהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לשגות הדמיה הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הרצוי, להסיר את הצלחת לתקן התרבויות 4% פוספט שנאגרו paraformaldehyde. זה יכול לשמש לניתוח מורפולוגי נוסף immunocytochemical. </li></ol> 5. ניתוח של התנועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת סדרת זמן מוקלט של תמונות לפורמט הנוח ביותר לעיבוד נוסף, TIFF להיות אחד נייד ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר תנועה של תאים בודדים לאורך זמן על ידי קואורדינטות XY הקלטה. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנה להורדה חופשית כמו ImageJ (NIH) עם מעקב ידני plug-in, או כל יישום מסחריים אחרים כגון ImagePro, Volicity או AutoQuant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הרצועות באמצעות Excel או in-house תוכנה שפותחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תא מעקב לחשב פרמטרים קינטיים כגון המהירות הממוצעת, עקמומיות של נתיב, השתנות כיוונית לאורך זמן, מסתעפת, סטייה לכיוון מקור של חלבונים, חישובים וכו &#39;יכול להיעשות MS Excel גיליון אלקטרוני או כל שווה ערך. הניסיון שלנו מראה זאת כי זה הרבה יותר פרודוקטיביים לפתח בתוך הבית סקריפטים (באמצעות R, Matlab, Python, Perl או אחרות, בעיקר שפות קוד פתוח), מאחר שהם מאפשרים התאמה אישית גמישים יותר הכללת שיטות אנליטיות מתוחכמות יותר מאלה זמין התקנה בסיסית של Excel. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים של origi אנטומיn של explants. זהו ציור של פרוסת העטרה של מוח החולדה hemisected. עיגולים אפורים לציין את האזור שממנו explants נלקחו. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. דיאגרמה של ההתקנה תרבות. הפיקדון חרוז הוא מקור חלבונים; explants ממוקמים משני צדי וכל האלמנטים מכוסים Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מגרשים מסלולים מקבילים תא בצבע ידי הרביעים (חיצים לעבר נקודת הפיקדון חרוז). מסלולים התא בצד ימין הם נודדים כלפי חלק ד &#39;, המופיע למשוך תאים, התאים בצד שמאל הן נודדות לעבר חלק, המופיע להדוף תאים נודדים. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. א &#39;) סדרה של תמונות שנבחרו timepoints מראה ענן גדל והולך של תאים נודדים מתוך explant. התא, למשל, מצוין על ידי חץ, היא מעקב באמצעות זמן כמפורט להלן (פס בהיקף 200μm). Explant זה היה דמיינו עם הדמיה לחיות 38 ח המוצג כאן הן תמונות של תאים עוזב את explant מתחילת ההקלטה תמונות התמונה הסופית. B) התא המצוין חלק בזמנים המצוין. תא מראה הסתעפות חוזרות (בר סולם 50μm).

<ol>
	<li>Caviness, V. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cortical+development:+a+view+from+mutations+in+mice.">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li><li>Gelman, D. M., Martini, F. J., N&#243;brega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons.">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li><li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia.">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li><li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., G&#246;tz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis.">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riding+the+glial+monorail:+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain.">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+neuronal+migration.">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li><li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes.">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li><li>M&#233;tin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Moln&#225;r, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development.">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li><li>Martini, F. J., Valiente, M., L&#243;pez Bendito, G., Szab&#243;, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li><li>N&#243;brega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors.">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li><li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+for+neuronal+migration.">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li><li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia.">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+neural+cell+migration.">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li><li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres.">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li><li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex.">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li></ol>

שימוש בבעלי חיים: כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם USUHS והנחיות NIH מוסדיים אושרה על ידי IACUC USUHS.

כאן אנו מציגים מערכת פשוטה ללמוד ולנתח את התנהגות הנדידה של תאים עצביים בתגובה לאותות כימיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו כדי לזהות מולקולות תאיים המשפיעים על תנועה של תאים. הפרדיגמה שלנו מבטיחה כי כל תא יחיד למד יש 3 מימדי (3D) בסביבה שבה לתקשר. זהו יתרון משמעותי על פני תרבויות שבה תאים נודדים מתוך explants נאלצים לנוע על המשטח השטוח של coverslip poly-D-ליזין מצופה, נטול ובכך של אינטראקציות עם תאי המטריצה ​​(למשל הירשברג ואח&#39; &#39;10:. 8. Metin et al. &#39;07). עם זאת ביחס בקנה מידה גדול יותר של תאים נודדים מעקב, הוא נשאר 2 מימדי, כמו תאים מוגבלים במאונך לשטח שבין coverslip הזכוכית בתחתית ואת המשטח העליון של Matrigel, שהוא דק יחסית חופש האופקי ההגירה. התקנה כזו מאפשרת ניתוח קל של התנועה, אשר נותר בעיקרו 2 מימדי. פרדיגמות 3D דומים המורכב explants GE או מחדש אגרגטים של תאים GE מוטבע קולגן או Matrigel, היו מועסקים בעבר באמצעות אגרגטים של תאים לבטא חלבון איתות מסוים כמקור לאותות כימיים (למשל Liodis ואח&#39; &#39;07;. מרטיני et .. א &#39;09:. Nóbrega-Pereira et al &#39;08, &#39;03 Wichterle et al).. השיטה המוצגת כאן משתמשת במערכת שחרור איטי בצורה של חרוזים לטקס עם חלבונים דבק כדי לאפשר רמת מתמשכת בסביבה המקומית, שהוא גבוה יותר מאשר חלבונים הוסיף ישירות בינוני, מה שהופך את המערכת מתאימה במיוחד כאשר כמות זמין חלבון מוגבלת או כאשר תערובת מורכבת של חלבונים נבדק. הבחירה של חרוזים אינה מוגבלת לטקס מוצרים מבוססי, והוא כולל גם חומרים אחרים, למשל חרוזים agarose, כל אחד עם מאפיינים שונים. כדי להגביר עוד יותר את הצפיפות של assay, השתמשנו בשני explants apposed להפקיד החרוזים משני צדי המתרס. כדי להבטיח אזור מסוים המוצא, השתמשנו explants רוממות ganglionic כמקור של תאים. הערכנו הבדלים מנות המדיאלי ו לרוחב של מקורבו ganglionic, אבל לא רואה שום הבדלים. עלינו להדגיש כי מחקר זה משתמש חמוסים, במינים זה יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב הפתיל מוקדם יותר מאשר אצל מכרסמים (Poluch ואח&#39; &#39;08.). באותו זמן התרבויות נוצרו (P0) יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב היו התמזגו, למרות תאים רבים לאכלוס הניאוקורטקס עדיין נמצאים שנוצר נודדות. עם זאת, אם מקור אחיד של תאים באמת עדיף, השעיה תא יכול להיות מוכן מרקמת גזור מעורב ישירות עם Matrigel, או לחילופין הסתחרר למטה גלולה כתוצאה אגרוף לעשות &quot;explants&quot;. השימוש לעיכול רקמת האנזימטית להכין את ההשעיה התא הוא מיואש, אפילו עקבות של פעילות שיורית proteolytic יכול לנזל Matrigel במהלך הניסוי. כמו כן, בדיקת נאותות צריך להיות מיושם על העיתוי של הגדרת התרבות. למרות Matrigel דורש תקופה של התחממות אל לפלמר, אפילו תקופה ממושכת מעט החשיפה של טיפות קטנות של Matrigel (משמש בפרוטוקול זה) לאוויר גורמת ייבוש תוצאות פגז כי הוא בלתי חדיר לתאי נודדות אשר לא ניתן למחוק על ידי כיסוי הבאים עם Matrigel טריים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </td><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> בינוני Neurobasal (1X), נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 מוסף (100x), נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 מוסף (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD ממברנה Matrigel מרתף מטריקס </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> האריס Uni-Core, גודל 0.5mm </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 69036-05 </td><td> פאנץ לשעמם </td></tr><tr><td> גרין Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc </td><td></td><td> לאטקס microspheres </td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

הגירה של תאים הוא תהליך משותף שמוביל לפיתוח ההבשלה של מערכת החולייתנים העצבים המרכזית (Hatten, 99). קליפת המוח מורכבת משני סוגי נוירונים בסיסיים: הגירוי ואת מעכבות. תאים אלה מתעוררות באזורים שונים ולנדוד לתוך קליפת בנתיבים שונים (פרלמן et al., 98). Interneurons מעכבות להעביר בעקיפין, ממקורות קורטיקליים, רובם מאזורים שונים של יואילו הוד מעלתם ganglionic (גלמן ואח&#39;, &#39;09;. שו ואח&#39;, &#39;04.). התנועה שלהם מחייב שליטה מדויקת spatiotemporal שהוטלו על ידי רמזים סביבתיים, כדי לאפשר הקמת cytoarchitecture קישוריות נאותה בקליפת המוח (Caviness &amp; Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). כדי לחקור את התנהגות הנדידה של תאים שנוצר באזורי שגשוג של יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ב חמוסים היילוד במבחנה השתמשנו הסדר 3 התרבות ממדי Matrigel BD מטריקס. הגדרת התרבות מורכבת משני explants GE ו מקור חלבונים נבדק מופק בקליפת המוח ואת adsorbed על פלורסנט Retrobeads לטקס התשיעי ממוקם בין explants (Hasling ואח&#39;, &#39;03;. Riddle et al, 97.). לאחר 2-3 ימים של תרבות, התאים מתחילים להופיע בקצה explant מראה נטייה לעזוב את רקמת בכיוון רדיאלי. הדמיה חיה מותר תצפית דפוסי הנדידה ללא צורך תיוג או סימון התאים. כאשר נחשף שברים של החלבון לחלץ המתקבל קליפת החמוס isochronic, התאים GE מוצג התנהגויות שונות כמו להישפט על ידי ניתוח כמותי הקינטית של תאים בודדים נעים.

Watch this Scientific Journal Video about Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures at JoVE.com

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

התנהגות הנדידה של תאים שנוצר תרבויות רוממות Ganglionic

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Views.  Uniformed Services University. זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.

Video: Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

מבחנים כדי זיהוי מבנים המשקף-UV ו לקבוע וחשיבותם העדפות Mate באמצעות מולי המפרש<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

שילוב התנהגות ו- EEG כדי לחקור את ההשפעות של מדיטציית מיינדפולנס על זיכרון אפיזודי

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...