נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

על ידי מדידת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של קרום התא, ניתן לפתור את שאלת המוכיחות העיקריות המווסתות את הפעילות החשמלית של התא. רישום מהדק טלאי של תא שלם היא טכניקה היקפית לחקר זרמים יוניים בתאים בודדים וחקרה את התגובה התאית לגירויים שונים. הביצועים הטובים ביותר על הקלטות מראש של מהדק טלאי תא שלם יושגו לאחר תרגול ולימוד רב.

כדי להתחיל דיסקציה מוחית, בצע חתך באמצעות מספריים כירורגיים בעור בחלק העליון של גולגולת החיה הערופה מקודל לרוסטרל והסר את הקרקפת. לאחר מכן, לחתוך את הצלחת inter parietal לאורך תפר sagittal עם מספריים הקשתית ולהסיר את עצם העורף. החליקו את האוסטאוטום מתחת לעצם הקודקוד ומשכו אותו החוצה בעדינות עד שהמוח נחשף.

לאחר חשיפת המוח, הפוך את הראש. הורידו בעדינות את המוח כדי לדמיין את העצב הטריגמינלי בכל צד. ואז לחתוך את העצב trigeminal באמצעות מספריים מעוקל Castroviejo.

לאחר הדמיה של ההיפותלמוס, זהה את עצב הראייה וחתך אותו בעדינות. לאחר מכן, לחתוך את החלק הקדמי הרחוק של האונה הקדמית. מוציאים את המוח ומיד טובלים אותו בתמיסת החיתוך עד לקבלת הפרוסות.

כדי לחתוך את דגימות המוח, הניחו את המוח על נייר סינון כדי לייבש את התמיסה העודפת. לאחר מכן, עם סכין גילוח חיתוך חד, לבצע חתך קורונלי המפריד את גזע המוח עם המוח הקטן משאר הרקמה. לאחר מכן, הדביקו את החלק הקאודל של המוח לבסיס הוויברטומה ומלאו את תא מכשיר החיתוך בתמיסת החיתוך או בתמיסת aCSF מקוררת לאפס עד שתי מעלות צלזיוס.

ארזו קרח יבש סביב תא הוויברטום כדי לשמור על תמיסת החיתוך קרה במהלך ההליך. הכנס את סכין הגילוח לוויברטום והגדר את פרמטרי החיתוך של המכשיר, כגון מהירות לשלוש, תדר לתשעה והזנה ל -250 מיקרומטר. במהלך הליך חיתוך הרקמה מעבירים את הפרוסות באמצעות פיפטת העברה אקרילית לתא ההתאוששות וממתינים 60 דקות לשחזור הרקמה לאחר רכישת הפרוסה.

לפני תחילת איטום התא והקלטתו, הפעל את המיקרוסקופ, המגבר, הדיגיטציה והמיקרו מניפולטור. בנה את תא ההקלטה המחובר למיקרוסקופ עם תמיסת aCSF. השתמש במשאבת זילוח כדי לחורר כל הזמן את aCSF בשני מיליליטר לדקה.

בדוק את הגדרות התוכנה וצור פרוטוקולים ספציפיים להקלטות בהתאם לסוג הניסוי. מעבירים פרוסת מוח מעניינת אחת בכל פעם לתא ההקלטה באמצעות פיפטת העברה אקרילית. החזיקו את הפרוסה עם עיגון פרוסה כדי שלא תזוז במהלך זילוח aCSF.

מקמו את הפרוסה במרכז תא ההקלטה באמצעות עדשת המטרה בהספק נמוך של המיקרוסקופ, 10X או 20X. מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגיע באופן מושלם למיקרופיפטה הקולטת. לאחר איתור אזור העניין יש להעביר את עדשת האובייקט לעדשה בעוצמה גבוהה, 63X ולהתמקד ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור היעד כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני השטח של פרוסת המוח.

כאשר תא יעד אפשרי ממוקם, סמן אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור פורמט כמו ריבוע מעל אזור העניין. סימן המסך של המחשב מסייע להנחות את מיקום פיפטת ההקלטה אל התא. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא המטרה, הרימו את המטרה והכניסו את מיקרופיפטת ההקלטה המלאה בתמיסה הפנימית במחזיק האלקטרודה, תוך הבטחת התמיסה הפנימית במגע עם אלקטרודת הכסף.

יש להפעיל לחץ חיובי לפני השקעת המיקרופיפטה בתמיסת aCSF באמצעות מזרק מלא אוויר של מיליליטר עד שלושה מיליליטר המחובר למחזיק המיקרופיפטה דרך צינור פוליאתילן כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה. באמצעות מיקרו מניפולטור להנחות את micropipette מתחת למרכז המטרה. הזז את לחצני המיקרו מניפולטור כדי להנחות את ציר XYZ של המיקרופיפטה לכיוון התא המעניין.

כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה ולקרב את הפוקוס, אך לא קרוב מדי לפרוסה. הפחיתו את מהירות המיקרו מניפולטור והורידו לאט לאט את המיקרופיפטה למישור המיקוד, וודאו שקצה המיקרופיפטה לא חודר בפתאומיות לפרוסה, אלא יורד לאט עד שהוא נוגע בפני השטח של התא או באזור המטרה. הפעלת לחץ חיובי קל עם מזרק מלא אוויר של מיליליטר עד שלושה מיליליטר כדי לפנות פסולת מנתיב הגישה.

הזז לאט את מניפולטור המיקרו על ציר XYZ כדי לקרב את קצה המיקרופיפטה ולגעת בתא היעד מה שגורם לגומה על ידי הלחץ המופעל. לאחר הקמת הגומה בעזרת מצב מהדק מתח בתוכנה, יש להחיל יניקה קצרה חלשה דרך הפה למשך שנייה עד שתיים דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האטימה בין המיקרופיפטה לתא. אם האטם נשאר יציב מכנית ללא הפרעות רעש למשך כדקה, כוונו את מתח האחיזה לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין.

עבור kisspeptin נוירונים היפותלמוס מינוס 50 מיליוולט מומלץ. לאחר מכן, יש למרוח יניקה קצרה דרך הפה כדי לשבור את קרום הפלזמה בקצה המיקרופיפטה האטומה לתא כך שהקרום הקרוע לא יסתום את המיקרופיפטה או ימשוך חלק גדול מהקרום או את התא. ניתן להשיג תצורה נאותה של תאים שלמים על ידי ביצוע יניקה בכוח מספיק.

בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. לאחר שבירת קרום התא, הפעל את אפשרות התא כולו במצב מהדק מתח ולחץ על הפקודה האוטומטית המפנה לכרטיסיית התא כולה. עמידות סדרת התא וקיבול התא כולו מחושבים באופן אוטומטי ומוצגים באופן מיידי על ידי התוכנה.

לאחר מכן, בדוק את פרמטרי כדאיות התא בתוכנה כמתואר בכתב היד של הטקסט. עקוב אחר התנגדות הסדרה וקיבול המצב היציב של התא במהלך הניסויים. לאחר שתצורת התא כולה מושגת כראוי, מדוד זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח.

רשום את השינויים בפוטנציאל קרום המנוחה ואת השינויים הפוטנציאליים של קרום המנוחה המושרה במצב המהדק הנוכחי. ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי על פעילותם של נוירוני קיספפטין היפותלמיים נחקרו בעזרת רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים. מתן הורמון גדילה רקומביננטי אנושי, HGH ב 20 מיקרוגרם לגרם גרם גרם היפרפולריזציה משמעותית של פוטנציאל קרום המנוחה ב -5 מתוך 12 נוירוני קיספפטין AVPV / PeN ו -9 מתוך 14 נוירוני קיספפטין ARH רשומים.

הנוירונים AVPV/PeN kisspeptin ו-ARH kisspeptin היפרפולריזציה שינו באופן משמעותי את פוטנציאל קרום המנוחה בהשוואה לתאים שאינם מגיבים. ההשפעות על פוטנציאל הממברנה במנוחה במהלך יישום HGH באו בעקבות הפחתה משמעותית של התנגדות הקלט של התא כולו של כ 0.9 עד 0.7 gigaohms על AVPV / PeN kisspeptin neurons ו 1.7 עד 1.0 gigaohms על נוירונים kisspeptin RH. במהלך קווי המוח המושלמים המבוצעים באמצעות ג'יגזיאל זהיר והאזור בתא באמצעות פרמטרים של חוף נדרשים כדי להשיג את ההקלטות הטובות ביותר של כל התא.

ניתן לאסוף את תמיסת המיקרופיפטה של התא המוקלט ולהשתמש בה עבור RTPCR של תא בודד המאפשר אפיון מולקולרי של תא מבודד. טכניקת מהדק טלאי של תאים שלמים בשילוב עם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית מהווה פריצת דרך בהבנת הרבייה המאפשרת הגדרה של נוירוני קיספפטין תכונות מוגברות, והם מודולטורים עיקריים.