השיטה נטולת האקסוגניות שלנו לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי היא התשובה לחששות הבטיחות הביולוגית סביב טיפול תאי כאשר היא נשקלת ליישום תרגומי. שיטות הבידוד וההרחבה שלנו פשוטות לשכפול, מהירות ודלות בדרישות טכניות, מה שהופך אותן לשימושיות לכולם. אנו חוקרים אסטרטגיית טיפול מבוססת תאי גזע שומניים אנושיים לתיקון עצבים היקפיים.
עם זאת, ניתן ליישם את הטכניקה שלנו באופן נרחב כאשר יש צורך בתאי גזע שומניים חדשים במערכי מחקר קליניים שונים. שמרנו על פשטות כדי לחסוך ביכולת ייצור קלה יותר. יש להקפיד על סטריליות מחדר ניתוח ועד לתרבית תאים.
עבור מניפולציה דגימה ושברים, דיסקציה מיקרו נמצאים בסיכון של זיהום. לאחר קבלת דגימת רקמת השומן מניתוח פלסטי בטן, באמצעות מספריים סטריליים, לחתוך אותו לחתיכות של כסנטימטר מרובע אחד. בעזרת אזמל, מנתחים במיקרו כל חתיכה לשברים קטנים יותר ומפזרים חמישה שברים בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים.
לחיבור שבר, השתמש באזמל כדי ליצור חתכים על משטח הפלסטיק וגרור כל שבר. בעדינות, מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום תרבית שלם כדי לכסות את כל השברים מבלי לנתק אותם ולדגור על צלחת הפטרי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. עקוב אחר התפשטות תאי הגזע שמקורם בשומן אנושי, או HASC, מדי יום תחת מיקרוסקופ אופטי עד שהתאים הופכים לנפגשים.
החלף את המדיום בתווך שלם טרי כל 72 שעות כדי להסיר פסולת תאים ולתת להם לגדול עד המעבר הראשון. ברגע שתרבית HASC מגיעה למפגש של 70% עד 80%, הסירו והשליכו את כל פיסות הרקמה באמצעות פינצטה סטרילית. כמו כן, השליכו את המדיום המותש והימנעו מהניתוק של HASC מצלחת הפטרי.
בזהירות לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר הסרת PBS, יש להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין ללא בעלי חיים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בדוק את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ אופטי ודגר במשך שתי דקות נוספות, במידת הצורך.
כדי לתמוך בניתוק התא, טפחו בעדינות על משטח הפלסטיק. עצור את פעולת הטריפסין על ידי הוספת שני מיליליטר של תווך מלא ולאסוף את כל התאים בצינור 15 מיליליטר. הסר את שארית הטריפסין על ידי צנטריפוגה.
לאחר השלכת הסופרנטנט, מרחפים את התאים בחמישה מיליליטר שלמים בינוניים ומעבירים את תרחיף התא לצלוחית T25 חדשה. לשימור קריו, ספרו אליציטוט של תאים מנותקים באמצעות מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי. צנטריפוגה את התאים ב 300 גרם במשך חמש דקות.
לאחר השלכת הסופרנטנט, מרחפים את התאים בתערובת ההקפאה בצפיפות של פי 10 עד לתאים השישיים למיליליטר ומעבירים מיליליטר אחד מתרחיף התא לבקבוקון קריו אחד. שים את בקבוקוני הקריו במינוס 80 מעלות צלזיוס במיכל הקפאה שמוריד את הטמפרטורה במעלה צלזיוס אחת לדקה ולאחר מכן העבר את בקבוקוני הקריו לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. בהופעת הצביר הראשונית, ה- HASCs הראו צורה קלאסית דמוית ציר והיו קטנים יותר, כמו גם מוארכים יותר בהשוואה לתאי הבקרה בנוכחות FBS.
האימונופנוטיפ של התא נראה דומה בין ה-HASCs שגודלו בתרבית עם שני התוספים. יותר מ 80 עד 90% של HASCs היו חיוביים עבור CD73 ו CD105 ופחות מ 5% מבוטא עבור CD34 ו CD45. לבסוף, בדיקת ההתפשטות חשפה עלייה משמעותית בצמיחת התאים כאשר נוספו לליזט טסיות הדם האנושי למדיום בהשוואה לבקרת FBS.
השלב החשוב ביותר הוא דיסקציה מיקרו של שברי שומן וחיבורם עם חתך אזמל על צלחת פטרי. אוכלוסיית תאי גזע שמקורם בשומן אנושי מוכנה לשימוש מתקבלת ביחס לקריטריוני הבטיחות הביולוגית GMP, שמירה על תכונות תאים טיפוליים ושיפור התרבות התאים.
