Nuestro método libre de exógenos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano es la respuesta a las preocupaciones de bioseguridad en torno a la terapia celular cuando se considera para su aplicación traslacional. Nuestros métodos de aislamiento y expansión son fáciles de replicar, rápidos y bajos en requisitos técnicos, lo que los hace útiles para todos. Investigamos la estrategia de terapia basada en células madre adiposas humanas para la reparación de nervios periféricos.
Sin embargo, nuestra técnica se puede aplicar ampliamente cuando se necesitan nuevas células madre adiposas en diferentes configuraciones de investigación clínica. Lo mantuvimos simple para conservar una producibilidad más fácil. La esterilidad debe observarse cuidadosamente desde el quirófano hasta el cultivo celular.
Para la manipulación de muestras y fragmentos, la microdisección corre el riesgo de contaminación. Después de obtener la muestra de tejido adiposo de la cirugía plástica abdominal, utilizando tijeras estériles, córtela en trozos de aproximadamente un centímetro cuadrado. Con un bisturí, micro diseccionar cada pieza en fragmentos más pequeños y dispersar cinco fragmentos en una placa de Petri de 10 centímetros.
Para la fijación de fragmentos, use un bisturí para crear incisiones en la superficie plástica y arrastre cada fragmento. Suavemente, agregue 10 mililitros de medio de cultivo completo para cubrir todos los fragmentos sin separarlos e incube la placa de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Monitoree la expansión diaria de la célula madre derivada de tejido adiposo humano, o HASC, bajo un microscopio óptico hasta que las células se vuelvan confluentes.
Reemplace el medio con un medio completo fresco cada 72 horas para eliminar los restos celulares y déjelos crecer hasta el primer paso. Una vez que el cultivo HASC alcance el 70 al 80% de confluencia, retire y deseche todas las piezas de tejido con pinzas estériles. Además, deseche el medio agotado evitando el desprendimiento del HASC de la placa de Petri.
Lave cuidadosamente las células con 10 mililitros de PBS. Después de eliminar PBS, agregue un mililitro de tripsina libre de animales e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Verifique si hay desprendimiento de células bajo un microscopio óptico e incube durante dos minutos más, si es necesario.
Para soportar el desprendimiento celular, golpee suavemente la superficie de plástico. Detenga la acción de la tripsina agregando dos mililitros de medio completo y recoja todas las células en un tubo de 15 mililitros. Eliminar la tripsina restante por centrifugación.
Después de desechar el sobrenadante, suspender las células en cinco mililitros de medio completo y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz T25. Para la criopreservación, cuente una alícuota de células separadas separadas utilizando el contador de células bajo un microscopio óptico. Centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos.
Después de desechar el sobrenadante, suspenda las células en la mezcla de congelación a una densidad de una vez de 10 a la sexta células por mililitro y transfiera un mililitro de la suspensión celular a un vial criogénico. Coloque los viales criogénicos a menos 80 grados centígrados en un recipiente de congelación que disminuya la temperatura en un grado centígrado por minuto y luego mueva los viales criogénicos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. En la apariencia inicial del racimo, las HSC mostraron una forma clásica de husillo y eran más pequeñas, así como más alargadas en comparación con las células de control en presencia de FBS.
El inmunofenotipo celular pareció ser similar entre las HASC cultivadas con los dos suplementos. Más del 80 al 90% de las HASC fueron positivas para CD73 y CD105 y menos del 5% se expresaron para CD34 y CD45. Finalmente, el ensayo de proliferación reveló un aumento significativo en el crecimiento celular cuando se agregó lisado de plaquetas humanas al medio en comparación con el control FBS.
El paso más importante es la microdisección de fragmentos adiposos y su fijación con incisión de bisturí en placa de Petri. Se obtiene una población de células madre derivadas de tejido adiposo humano listo para usar con respecto a los criterios de bioseguridad GMP, manteniendo las propiedades celulares terapéuticas y mejorando la proliferación celular.
