İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

İnsan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için ekzojenik içermeyen yöntemimiz, translasyonel uygulama için düşünüldüğünde hücre tedavisi ile ilgili biyogüvenlik endişelerine cevaptır. Yalıtım ve genişletme yöntemlerimizin çoğaltılması kolay, hızlı ve teknik gereksinimleri düşüktür, bu da onları herkes için yararlı kılar. Periferik sinir onarımı için insan yağ kök hücre bazlı tedavi stratejisini araştırıyoruz.

Bununla birlikte, tekniğimiz farklı klinik araştırma kurulumlarında yeni yağ kök hücrelerine ihtiyaç duyulduğunda yaygın olarak uygulanabilir. Daha kolay üretilebilirliği korumak için bunu basit tuttuk. Sterilite, ameliyathaneden hücre kültürüne kadar dikkatlice gözlemlenmelidir.

Numune manipülasyonu ve fragmanlar için mikro diseksiyon kontaminasyon riski altındadır. Karın plastik cerrahisinden yağ dokusu örneği alındıktan sonra, steril makas kullanarak, yaklaşık bir santimetrekarelik parçalara bölün. Bir neşter ile, mikro her parçayı daha küçük parçalara ayırır ve 10 santimetrelik bir Petri kabında beş parça dağıtır.

Parça tutturmak için, plastik yüzeyde kesikler oluşturmak için bir neşter kullanın ve her parçayı sürükleyin. Nazikçe, tüm parçaları ayırmadan örtmek için 10 mililitre tam kültür ortamı ekleyin ve Petri kabını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnsan adipoz türevi kök hücreyi veya HASC'ı, hücreler birleşene kadar optik mikroskop altında günlük olarak genişletin.

Hücre kalıntılarını çıkarmak ve ilk geçişe kadar büyümelerini sağlamak için ortamı her 72 saatte bir taze bir tam ortamla değiştirin. HASC kültürü% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, steril cımbız kullanarak tüm doku parçalarını çıkarın ve atın. Ayrıca, HASC'ın Petri kabından ayrılmasından kaçınarak yorgun ortamı atın.

Hücreleri 10 mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre hayvansız tripsin ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Optik mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve gerekirse iki dakika daha inkübe edin.

Hücre ayrılmasını desteklemek için, plastik yüzeye hafifçe dokunun. İki mililitre tam ortam ekleyerek tripsin hareketini durdurun ve tüm hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Kalan tripsi santrifüjleme ile çıkarın.

Süper nantantı attıktan sonra, hücreleri beş mililitre tam ortamda askıya alın ve hücre süspansiyonunu yeni bir T25 şişesine aktarın. Kriyografyanın korunması için, optik mikroskop altında hücre sayacını kullanarak ayrılan müstakil hücrelerin bir aliquotunu sayın. Hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.

Süpernatanı attıktan sonra, dondurucu karışımdaki hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 kat daha fazla yoğunlukta askıya alın ve hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir kriyo şişesine aktarın. Kriyo şişelerini eksi 80 santigrat dereceye kadar sıcaklığı dakikada bir santigrat derece düşüren dondurucu bir kaba koyun ve ardından kriyo şişelerini uzun süreli depolama için sıvı nitrojene taşıyın. İlk küme görünümünde, HASC'ler klasik iğ benzeri bir şekil gösterdi ve FBS varlığında kontrol hücrelerine kıyasla daha küçük ve daha uzundu.

Hücre immünofenotipinin, iki takviye ile kültürlenen HASC'ler arasında benzer olduğu görülmüştür. HASC'lerin %80-90'ından fazlası CD73 ve CD105 için pozitif, %5'inden azı CD34 ve CD45 için eksprese edildi. Son olarak, proliferasyon testi, FBS kontrolüne kıyasla ortama insan trombosit lizatı eklendiğinde hücre büyümesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur.

En önemli adım yağ parçalarının mikro diseksiyonu ve Petri kabında neşter kesisi ile bağlanmalarıdır. GMP biyogüvenlik kriterlerine göre kullanıma hazır insan adipoz kaynaklı kök hücre popülasyonu elde edilir, terapötik hücre özellikleri korunur ve hücre proliferasyonunu arttırır.