Nosso método livre de exogenia para isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é a resposta para as preocupações de biossegurança em torno da terapia celular quando é considerada para aplicação translacional. Nossos métodos de isolamento e expansão são simples de replicar, rápidos e com poucos requisitos técnicos, tornando-os úteis para todos. Investigamos a estratégia terapêutica baseada em células-tronco adiposas humanas para o reparo de nervos periféricos.
No entanto, nossa técnica pode ser amplamente aplicada quando novas células-tronco adiposas são necessárias em diferentes configurações de pesquisa clínica. Mantivemos a simplicidade para conservar uma produtibilidade mais fácil. A esterilidade deve ser cuidadosamente observada desde a sala de cirurgia até a cultura celular.
Para a manipulação de amostras e fragmentos, a microdissecção está em risco de contaminação. Após a obtenção da amostra de tecido adiposo da cirurgia plástica abdominal, utilizando tesoura estéril, corte-a em pedaços de aproximadamente um centímetro quadrado. Com um bisturi, micro disseque cada peça em fragmentos menores e disperse cinco fragmentos em uma placa de Petri de 10 centímetros.
Para fixação de fragmentos, use um bisturi para criar incisões na superfície de plástico e arraste cada fragmento. Suavemente, adicione 10 mililitros de meio de cultura completo para cobrir todos os fragmentos sem separá-los e incubar a placa de Petri a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Monitore a expansão da célula-tronco derivada do tecido adiposo humano, ou HASC, diariamente sob um microscópio óptico até que as células se tornem confluentes.
Substitua o meio por um meio fresco e completo a cada 72 horas para remover os detritos celulares e deixá-los crescer até a primeira passagem. Quando a cultura HASC atingir 70 a 80% de confluência, remova e descarte todos os pedaços de tecido usando pinças estéreis. Além disso, descarte o meio exausto evitando o desprendimento do HASC da placa de Petri.
Lave cuidadosamente as células com 10 mililitros de PBS. Depois de remover o PBS, adicione um mililitro de tripsina livre de animais e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique se há descolamento celular sob um microscópio óptico e incube por mais dois minutos, se necessário.
Para apoiar o descolamento da célula, toque suavemente na superfície do plástico. Pare a ação da tripsina adicionando dois mililitros de meio completo e colete todas as células em um tubo de 15 mililitros. Remova a tripsina restante por centrifugação.
Após a eliminação do sobrenadante, suspender as células em meio completo de cinco mililitros e transferir a suspensão celular para um novo balão T25. Para a preservação criogênica, conte uma alíquota de células desanexadas usando o contador de células sob um microscópio óptico. Centrifugar as células a 300 G durante cinco minutos.
Depois de descartar o sobrenadante, suspender as células na mistura de congelamento a uma densidade de uma vez 10 até a sexta célula por mililitro e transferir um mililitro da suspensão celular para um frasco para injetáveis de crio. Coloque os frascos de crio a menos 80 graus Celsius em um recipiente de congelamento que diminua a temperatura em um grau Celsius por minuto e, em seguida, mova os frascos de crio para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Na aparência inicial do cluster, os HASCs apresentaram uma forma clássica de fuso e foram menores, bem como mais alongados em comparação com as células de controle na presença de FBS.
O imunofenótipo celular pareceu ser semelhante entre os HASCs cultivados com os dois suplementos. Mais de 80 a 90% dos HASCs foram positivos para CD73 e CD105 e menos de 5% expressos para CD34 e CD45. Finalmente, o ensaio de proliferação revelou um aumento significativo no crescimento celular quando o lisado plaquetário humano foi adicionado ao meio em comparação com o controle FBS.
O passo mais importante é a microdissecção de fragmentos adiposos e sua fixação com incisão de bisturi em placa de Petri. Uma população de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano pronta para uso é obtida em relação aos critérios de biossegurança GMP, mantendo as propriedades celulares terapêuticas e aumentando a proliferação celular.
