Isolement et culture de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux à l’aide d’une méthode innovante sans xénogène pour la thérapie humaine

Notre méthode sans exogène pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux est la réponse aux préoccupations de biosécurité liées à la thérapie cellulaire lorsqu’elle est envisagée pour une application translationnelle. Nos méthodes d’isolation et d’extension sont simples à reproduire, rapides et peu exigeantes en termes techniques, ce qui les rend utiles à tous. Nous étudions la stratégie thérapeutique basée sur les cellules souches adipeuses humaines pour la réparation des nerfs périphériques.

Cependant, notre technique peut être largement appliquée lorsque de nouvelles cellules souches adipeuses sont nécessaires dans différentes configurations de recherche clinique. Nous avons gardé les choses simples pour conserver une production plus facile. La stérilité doit être soigneusement observée de la salle d’opération jusqu’à la culture cellulaire.

Pour la manipulation d’échantillons et les fragments, la microdissection présente un risque de contamination. Après avoir obtenu l’échantillon de tissu adipeux de la chirurgie plastique abdominale, à l’aide de ciseaux stériles, coupez-le en morceaux d’environ un centimètre carré. Avec un scalpel, micro disséquer chaque morceau en fragments plus petits et disperser cinq fragments dans une boîte de Petri de 10 centimètres.

Pour la fixation des fragments, utilisez un scalpel pour créer des incisions sur la surface en plastique et faites glisser chaque fragment. Ajoutez délicatement 10 millilitres de milieu de culture complet pour couvrir tous les fragments sans les détacher et incuber la boîte de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Surveiller quotidiennement l’expansion quotidienne des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain, ou HASC, au microscope optique jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes.

Remplacez le milieu par un milieu complet frais toutes les 72 heures pour éliminer les débris cellulaires et laissez-les pousser jusqu’au premier passage. Une fois que la culture HASC atteint 70 à 80% de confluence, retirez et jetez tous les morceaux de tissu à l’aide d’une pince à épiler stérile. Jetez également le milieu épuisé en évitant le détachement du HASC de la boîte de Pétri.

Lavez soigneusement les cellules avec 10 millilitres de PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez un millilitre de trypsine sans animaux et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez s’il y a décollement de cellules au microscope optique et incuber pendant deux minutes de plus, si nécessaire.

Pour soutenir le détachement de cellule, tapotez doucement la surface en plastique. Arrêtez l’action de la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu complet et recueillez toutes les cellules dans un tube de 15 millilitres. Éliminer la trypsine restante par centrifugation.

Après avoir jeté le surnageant, suspendre les cellules dans un milieu complet de cinq millilitres et transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T25. Pour la cryoconservation, compter une partie aliquote des cellules détachées à l’aide du compteur de cellules au microscope optique. Centrifuger les cellules à 300 G pendant cinq minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, suspendre les cellules dans le mélange de congélation à une densité d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre et transférer un millilitre de la suspension cellulaire dans un flacon cryogénique. Placez les flacons cryogéniques à moins 80 degrés Celsius dans un récipient de congélation qui diminue la température d’un degré Celsius par minute, puis déplacez les flacons cryogéniques dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Dans l’apparence initiale de la grappe, les HASC présentaient une forme classique en forme de fuseau et étaient plus petites, ainsi que plus allongées par rapport aux cellules témoins en présence de FBS.

L’immunophénotype cellulaire semblait être similaire entre les HASC cultivés avec les deux suppléments. Plus de 80 à 90 % des HASC étaient positifs pour CD73 et CD105 et moins de 5 % exprimés pour CD34 et CD45. Enfin, le test de prolifération a révélé une augmentation significative de la croissance cellulaire lorsque du lysat plaquettaire humain a été ajouté au milieu par rapport au témoin FBS.

L’étape la plus importante est la micro-dissection des fragments adipeux et leur fixation avec incision au scalpel sur une boîte de Pétri. Une population de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux prête à l’emploi est obtenue en respectant les critères de biosécurité BPF, en conservant les propriétés cellulaires thérapeutiques et en améliorant la prolifération cellulaire.