רז זריבך נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 163/22). תומר אלי בן יוסף ואריה מורן נתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מס' 2047/20). ברצוננו להודות לדניאל גיטלר ולקבוצתו באוניברסיטת בן-גוריון על שיתוף הפעולה, התמיכה והמומחיות.

1. טרנספקציה של תאים
<ol><li>תרבית HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C/5% CO2 עד למפגש על צלחת של 10 ס"מ (8.8 x 106 תאים בסך הכל).</li>
	<li>מניחים מכסה אחד בקוטר 13 מ"מ בכל אחת מהבארות של צלחת בת 12 בארות. לדלל 0.44 x 106 תאים טריפסיניים משלב 1.1 ב 12 מ"ל של DMEM מלא. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים. מלא כל באר עם 1 מ"ל של פתרון מעורב. לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C / 5% CO2 בן לילה.</li>
	<li>החלף את ה-DMEM המלא בכל באר ב-1 מ"ל DMEM ללא סרום (ראה טבלת חומרים) בכל באר. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.</li>
	<li>עבור כל באר טרנספקציה, לדלל 1 מיקרוגרם של פלסמיד pAAV2 המכיל את החלבון של עניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי mCherry (קובץ משלים 1) ב 100 μL של DMEM ללא סרום בצינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 3 מיקרוגרם של פוליאתילנאימין (PEI, ראה טבלת חומרים) ל- 100 מיקרוליטר DMEM ללא סרום לכל טרנספקציה, כאשר כל טרנספקציה בצינור אחר של 1.5 מ"ל. יחס פלסמיד:PEI צריך להיות 1:3 (מיקרוגרם:מיקרוגרם).</li>
	<li>מערבלים את שני הצינורות משלב 1.4 ושלב 1.5 למשך 10 שניות, ומשאירים לנוח בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפחות.</li>
	<li>ערבב חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת ה- DNA משלב 1.4 עם חלק אחד (100 μL לכל באר) של תמיסת PEI משלב 1.5. מערבול את הפתרון הסופי במשך 10 שניות, ולהשאיר אותו לנוח בטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות עד 6 שעות.</li>
	<li>קח את צלחת 12 בארות מהאינקובטור. מערבלים את הפתרון הסופי משלב 1.7, ומוסיפים 200 μL לכל אחת מהבארות בלוח 12 הקידוחים משלב 1.3. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח (שלב 1.1).</li>
	<li>לאחר 3 שעות, להחליף את המדיום בכל באר עם 1 מ"ל של DMEM מלא. החזירו את צלחת 12 הקידוחים לאינקובטור הלח כמו בשלב 1.1.</li>
	<li>לאחר יומיים, קח את תרבית התאים הנגועים מאינקובטור 37 ° C / 5% CO2 , והנח אותה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באמצעות הגדלה פי 10.</li>
	<li>באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ, התמקדו בתאים תוך שימוש באור שדה בהיר.</li>
	<li>עברו לעירור פלואורסצנטי של דובדבן (587 ננומטר) ולאורכי גל של פליטה (610 ננומטר), וכבו את אור השדה הבהיר. בדוק את הפלואורסצנטיות של התאים כדי לאשר את הביטוי של ZnT1 mCherry.</li>
	<li>הכינו את תמיסת העמסת הצבע.<ol><li>קח aliquot של 4 μL של צבע פלואורסצנטי ספציפי אבץ (ראה טבלה של חומרים) בצורת אסטר אצטוקסימתיל (AM) שלה, מומס DMSO (1 מיקרוגרם / μL), ממלאי מוגן אור מאוחסן במקפיא -20 ° C. צורה זו מאפשרת לצבע להיכנס לתא דרך קרום הפלזמה על ידי דיפוזיה פשוטה.</li>
		<li>הוסף 4 μL של 10% חומצה פלורונית (או 2 μL של 20% חומצה פלורונית, ראה טבלת חומרים) לאליציטוט משלב 1.13.1. מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף את כל 8 μL לצינור 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 750 μL של תמיסה של רינגר (מוכן בבית, ראה טבלה של חומרים להרכב) בתוספת 1 מ"ג / מ"ל (~ 0.1%) אלבומין בסרום בקר לצינור משלב 1.13.2, ומערבל במרץ. מוסיפים עוד 750 μL של אותה תמיסה, ומערבלים שוב כדי להבטיח ערבוב מקסימלי.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 750 μL של הפתרון הסופי משלב 1.13.3 לשתי בארות בלוח תרבית חדש בן 6 בארות. מכסים ברדיד אלומיניום. הערה: כדי למנוע הלבנה, צלחת 6 הבארות מכוסה תמיד ברדיד אלומיניום משלב זה.</li>
	<li>בעזרת טוויטר עדין, קחו עד ארבע כיסויים משוכפלים מצלחת תרבית התאים הנגועה, והניחו אותם בבאר המלאה הראשונה (עד ארבע שקופיות לכל באר) של הצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים משלב 1.14. חזור על תהליך זה עבור השני מלא היטב. הערה: כל הכיסויים באותה באר מלאה חייבים להיות מאותו מצב. עם זאת, כל באר יכולה להכיל תנאים שונים.</li>
	<li>מכסים ברדיד אלומיניום ומנערים בעדינות במשך 15-20 דקות.</li>
	<li>הסר את תמיסת העמסת הצבע והחלף אותה בתמיסת כביסה חדשה של אלבומין פלוס של רינגר, כפי שנעשה בו שימוש בשלב 1.13.3. מכסים ברדיד אלומיניום. השאירו לנער שוב למשך 20 דקות. זה מאפשר את המחשוף של אסטר AM על ידי אסטרזות תאיות.</li>
</ol>2. הכנת מיקרוסקופ
<ol><li>סדרו את הכלים הדרושים (ראו טבלת חומרים) כאמור: מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המסוגל לזהות פלואורופורים מסוג GFP ו-mCherry, מערכת זילוח המאפשרת מעבר בין שתי תמיסות לפחות, מערכת יניקה ותא זילוח.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ, את מקור האור שלו ואת המצלמה. הפעל את מערכת היניקה.</li>
	<li>לשטוף את מערכת זילוח. שטפו את התא הראשון בתמיסת רינגר ואת התא השני בתמיסת רינגר המכילה תמיסת אבץ 7 מיקרומטר בתוספת פיריתיון 7 מיקרומטר (יונופור אבץ, ראו טבלת חומרים). כדי למנוע בועות אוויר או רווחים, השאירו מעט נוזלים בכל חדר. הערה: מכיוון ששני המיכלים מחוברים לאותו צינור המחובר לתא הזילוח, יש לוודא תמיד שהמקטע המשותף נשטף בתמיסת רינגר.</li>
	<li>סגרו את הברזים, ומלאו את התאים המתאימים בתמיסת רינגר ותמיסת אבץ של רינגר, כמו בשלב 2.3.</li>
</ol>3. הכנת מדגם
<ol><li>קחו את תא הזילוח והניחו אותו כשהצד הצר של החריץ פונה כלפי מעלה. הערה: החריץ הוא חור באמצע תא הזלוף. זה מאפשר לנוזל הזלוף גישה לתאים. צד אחד של החריץ צר, והצד הנגדי רחב.</li>
	<li>יש למרוח סיליקון איטום (ראו טבלת חומרים) סביב החריץ. נקו כל סיליקון איטום מהחריץ בעזרת קצה פיפטה. הערה: ודא שיש מספיק אטם סיליקון סביב החריץ כדי לאטום כיסוי בקוטר 22 מ"מ.</li>
	<li>בעזרת טוויטר עדין, קחו פתק כיסוי מתמיסת הכביסה, והניחו אותו על גבי החריץ כשהתאים פונים כלפי מטה. בדרך זו, התאים ייחשפו לתמיסה המנקבת את החריץ במהלך הניסוי.</li>
	<li>הניחו מכסה בקוטר 22 מ"מ על גבי הכיסוי בקוטר 13 מ"מ, והדקו אותו באמצעות הטוויטר. היזהרו לא לפצח את הכיסויים.</li>
	<li>הפוך את התא, ולחץ עליו כדי לשחרר את כל הנוזלים הנוכחיים. מלאו את החריץ ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הכביסה של רינגר ולחצו שוב כדי לוודא שאין דליפה. הערה: אם מתגלה נזילה, יש למרוח חומר איטום במקום הנזילה ולבצע בדיקה חוזרת.</li>
	<li>הרכיבו את תא הזילוח על הרציף, ואבטחו אותו. הניחו את צינורות הזילוח והיניקה כדי לאפשר זילוח על התאים בחריץ.</li>
	<li>שנו את קצב הזילוח לכ-2 מ"ל/דקה, והפעילו את הזלוף של תמיסת הצלצול. ודא שמערכת הזילוח פועלת ללא דליפה או זליגה.</li>
</ol>4. הכנת מדידה
<ol><li>פתח את תוכנת ההדמיה (ראה רשימת חומרים) על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. התחבר עם האישורים הרלוונטיים. בחר את המצלמה המצורפת ולחץ על אישור.</li>
	<li>הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל -10x באמצעות הלחצן בצד שמאל של המיקרוסקופ.</li>
	<li>בחירת תצוגה חיה ושימוש בג'ויסטיק, הזז את הפלטפורמה כדי להתמקד בתאים בחריץ.</li>
	<li>בזמן שהזילוח דולק, כבה את האורות ושנה את אורך הגל ל- mCherry על ידי לחיצה על הכפתור הייעודי בממשק. כוונן את המיקוד באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ.</li>
	<li>ברגע שהמיקרוסקופ מתמקד בתאים, הזיזו את הפלטפורמה באמצעות הג'ויסטיק כדי לאפשר בחירה של טלאי התאים המתאימים. הערה: אזור מתאים נחשב לאזור עם לפחות 10 תאים עבור החזר השקעה ואזור ריק עבור רקע.</li>
	<li>בחר בתפריט הנפתח הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ובחר צייר החזר השקעה מעגלי.</li>
	<li>צייר ROI של אשכולות תאים עם התאים המבטאים mCherry (מציין את הביטוי של ZnT1).</li>
	<li>מאותו סרגל כלים כמו שלב 4.6, לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי של החזר השקעה ברקע והתאם את המיקום והגודל של החזר ההשקעה על הרקע לאזור ללא תאים כלל.<ol><li>בדוק עם אורכי הגל mCherry ו- EGFP כדי לוודא שאין תאים בהחזר ההשקעה על הרקע שנבחר. הערה: אורכי הגל הותאמו כך ש-mCherry השתמש באורך גל עירור של 520 ננומטר ובאורך גל פליטה של 610 ננומטר ו-EGFP השתמש באורך גל עירור של 470 ננומטר ובאורך גל פליטה של 520 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר בכרטיסיית המשנה אורך גל (λ). סמן את תיבת הסימון שלו וודא שאורך הגל של GFP קיים ותיבת הסימון שלו מסומנת. אם לא, הוסף וסמן אותו.</li>
	<li>בחר בכרטיסיה המשנה משך . הגדר את מרווח המדידה כ- 5 שניות, ושנה את מספר המרווחים כך שיתאימו למשך הניסוי.</li>
	<li>באזור פוקוס בלוח המיקרוסקופ מתחת לעינית, לחץ על כפתור מופעל כדי להפעיל את מערכת המיקוד המושלם (PFS).</li>
	<li>באמצעות גלגל המיקוד של PFS, התאם את המיקוד. בממשק התוכנה, תחת ND Acquisition, ודא ש - PFS מופעל מסומן.</li>
	<li>לחץ על הפעל כעת.</li>
</ol>5. הליך ניסיוני
<ol><li>התחל במדידת תקופת הבסיס של 90 שניות באמצעות זילוח הפתרון של Ringer.</li>
	<li>לאחר סיום תקופת ההתחלה, כבה את זילוח התמיסת של הצלצול ולאחר מכן הפעל את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול. סמן את החלפת הפתרון על ידי לחיצה על הדגל האדום בפינה השמאלית התחתונה של לוח הממשק הראשי. צפויה להופיע עלייה בפלואורסצנטיות.</li>
	<li>ברגע שעליית הפלואורסצנטיות מתחילה להרוות, החליפו בחזרה לזילוח עם התמיסה של רינגר. כבו את זילוח תמיסת האבץ של הצלצול ולאחר מכן הפעילו את זילוח התמיסה של הצלצול.</li>
	<li>המתן עד שזמן הניסוי יפוג. צפויה ירידה ניכרת אך יציבה בפלואורסצנטיות אם ה-ZnT1 פועל כראוי.</li>
</ol>6. ייצוא נתונים
<ol><li>כדי לייצא את הנתונים עם חיסור בסיסי, לחץ על הלחצן Subtract Baseline והצג את השינויים בחלון הרכישה ND.</li>
	<li>לחץ על כפתור ייצוא בממשק התוכנה בחלון "רכישת ND". גליון נתונים של Excel ייפתח. שמור במיקום הרצוי.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>עבור כל החזר השקעה, צור פלואורסצנטיות בסיסית ממוצעת בין 90 ל-100 השניות הראשונות.</li>
	<li>בטא את הפלואורסצנטיות המחושבת עבור כל החזר השקעה כאחוז מהרקע עבור החזר השקעה זה.</li>
	<li>צור ממוצע שורה של כל החזר ההשקעה והתווה את התוצאה כתרשים קווי. זה יוצר ממוצע של כל ה- ROI כפונקציה של זמן.</li>
	<li>באמצעות פונקציית ההתאמה הליניארית, בחר את הקצב ההתחלתי לירידה בפלואורסצנטיות לאחר השטיפה עם תמיסת רינגר. ערך השיפוע של המשוואה מתואם עם קצב ההובלה.</li>
</ol>

חקירת מנגנון הובלת אבץ בתאי יונקים באמצעות בדיקת FluoZin-3

<ol>
	<li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase.">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li><li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron,+zinc,+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells.">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li><li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Biochemistry:+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life.">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li><li>Kimura, T., Kambe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+metallothionein+and+ZIP+and+ZnT+transporters:+An+overview+and+perspective.">The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).</li><li>Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+ZIP+and+ZnT+zinc+transporters+in+human+health+and+diseases.">Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).</li><li>Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological,+biochemical,+and+molecular+roles+of+zinc+transporters+in+zinc+homeostasis+and+metabolism.">The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).</li><li>Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporters+as+potential+therapeutic+targets:+An+updated+review.">Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).</li><li>Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporters+and+their+functional+integration+in+mammalian+cells.">Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).</li><li>Huang, L., Tepaamorndech, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC30+family+of+zinc+transporters+-+A+review+of+current+understanding+of+their+biological+and+pathophysiological+roles.">The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).</li><li>Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+zinc+transporter+protein-1+(ZnT-1)+in+the+brain+of+subjects+with+mild+cognitive+impairment,+early,+and+late-stage+Alzheimer's+disease.">Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease.</a> Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).</li><li>Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+zinc+transporter+proteins+ZnT-1,+ZnT-4+and+ZnT-6+in+preclinical+Alzheimer's+disease+brain.">Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain.</a> Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).</li><li>Tsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+zinc+transporter+gene,+ZnT-1,+is+induced+after+transient+forebrain+ischemia+in+the+gerbil.">Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).</li><li>Palmiter, R. d., Findley, S. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+mammalian+zinc+transporter+that+confers+resistance+to+zinc.">Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc.</a> The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).</li><li>Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+overview+of+the+zinc+transporters+in+the+cation+diffusion+facilitator+family.">A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).</li><li>Shapiro, S. S., Wilk, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+variance+test+for+normality+(complete+samples).">An analysis of variance test for normality (complete samples).</a> Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).</li><li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+a+test+of+whether+one+of+two+random+variables+is+stochastically+larger+than+the+other.">On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li><li>Darling, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov,+Cramer-von+Mises+tests.">The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+zinc+in+living+cells.:+A+new+generation+of+sensitive+and+selective+fluorescent+probes.">Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes.</a> Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).</li><li>Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mitochondrial+fluorescent+zinc+sensor.">A new mitochondrial fluorescent zinc sensor.</a> Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).</li><li>Hessels, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eZinCh-2:+A+versatile,+genetically+encoded+FRET+sensor+for+cytosolic+and+intraorganelle+Zn2++imaging.">eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging.</a> ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).</li><li>S&#225;nchez-Mart&#237;n, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsphere-based+real-time+calcium+sensing.">Microsphere-based real-time calcium sensing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).</li><li>Namdarghanbari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+the+zinc+sensor+FluoZin-3+with+Zn7-metallothionein:+Inquiry+into+the+existence+of+a+proposed+weak+binding+site.">Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).</li><li>Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+intracellular+free+calcium+and+zinc+using+fura-2FF+and+FluoZin-3.">Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3.</a> Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

השיטה המתוארת לעיל מאפשרת מדידה ישירה של ריכוז האבץ התוך תאי ברזולוציה טמפורלית גבוהה. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו הכוללת ניטור שינויים ב- Zn2+ תוך תאי יכולה להפחית באופן משמעותי את רעשי הרקע. בנוסף, הסלקטיביות של הצבע עבור אבץ מבטלת אינטראקציות צולבות פוטנציאליות עם קטיונים מתכתיי?...

אבץ הוא יסוד קורט חיוני בסביבה התאית. הוא משלב שליש מכלל החלבונים ומעורב בתהליכים תאיים שונים, כגון קטליזה1, שעתוק2 ומוטיבים מבניים3. עם זאת, למרות היותו אינרטי חמצון-חיזור, ריכוזי אבץ גבוהים רעילים לתא, ולכן אף אורגניזם יונקים לא שרד ללא נוכחות מנגנונים המווסתים את הומאוסטזיס האבץ. ביונקים, שלושה מנגנונים אחראים לתהליך זה: (1) מטלותיונינים, שהם חלבונים עשירים בציסטאין ציטוסולי הקושרים אבץ בזיקה גבוהה, ובכך מונעים עודף אבץ ציטוסולי חופשי4; (2) חלבונים דמויי Zrt/Irt (ZIPs), שהם מובילי אבץ האחראים לזרימת אבץ לתוך הציטוזול דרך קרום הפלזמה או מאברונים תוך-תאיים 4,5,6,7,8; ו-(3) ZnTs, שהם תת-קבוצה של יונקים ממשפחת CDF (cation diffusion facilitator) הנמצאים בכל מקום, והם מובילי אבץ, מכיוון שהם מפיצים אבץ מהציטוזול דרך קרום הפלזמה או לתוך האברונים התוך-תאיים 4,5,6,7,8,9. בשל חשיבותו של אבץ לחילוף החומרים בתאים, חיוני להבין את הדינמיקה של אבץ בתאים.
שיטות קודמות להערכת דינמיקת אבץ התמקדו בהערכת רמות הביטוי של mRNA בתנאי אבץ שונים, על-ידי קורלציה שלהן למדידות אבץ בתאים של רקמות קבועות או תאים10,11,12. שיטות אלה כוללות זיהוי כימי וצביעה אימונוהיסטוכימית. עם זאת, שיטות אלה מניבות רק מדדים עקיפים, ולכן קובעות רק מתאם לא מקוון בין ריכוז אבץ תוך-תאי לבין ביטוי מובילי אבץ. כתוצאה מכך, שיטות אלה אינן יכולות להסיק פרמטרים הדורשים רזולוציה זמנית גבוהה.
מדידה ישירה יותר של הובלת Zn2+ משתמשת באיזוטופים רדיואקטיביים של אבץ13. שיטה זו מסתמכת על מדידה של Zn2+ המסומן ברדיו כדי לנטר את הובלת האבץ ואת הקינטיקה שלו. עם זאת, בשל חשיבותו של אבץ להומאוסטזיס תאי, תהליכים תאיים מרובים מווסתים את ריכוז האבץ התוך-תאי. בין אלה קשירה חוץ-תאית ומספר מערכות תחבורה הפועלות בתיאום כדי לשמור על שליטה הדוקה ברמות Zn2+ תוך תאי. השילוב של תהליכים אלה יוצר רעשי רקע ניכרים, מה שמקשה על בדיקת פונקציות הובלה בודדות הקשורות לאבץ.
מאמר זה מדגים שיטה לניטור ישיר של קצב העברת האבץ על-ידי מדידת ריכוז האבץ החופשי התוך-תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. לצבע יש סגוליות גבוהה עבור Zn2+ והפרעה מועטה מקטיונים דו-ערכיים אחרים, כגון סידן. בנוסף, בצורתו אסטר, הוא נכנס לתאים על ידי דיפוזיה nonionic ולאחר מכן הוא לכוד עקב הפעילות של di-esterase תאי. לפיכך, הפלואורסצנטיות שלו מתואמת בעיקר עם ריכוז האבץ הציטוסולי החופשי. ניסויים אלה נערכו כדי לחקור את הקשר מבנה-פונקציה של טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1), חבר במשפחת ZnT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm coverslips</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>111530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm cover slides</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>101050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>bioWorld</td>
			<td>22070008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Glentham Life Science</td>
			<td>GC6947</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#8217;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH</td>
			<td>Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-55-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F24195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 0.8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HEPES10</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo 5.5 sCMOS camera</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DC-152Q-FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>163823</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrithione</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3261</td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>W4 64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190305</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 120 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31665</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mammalian zinc transporters using an in vitro zinc transport assay

מתכות מעבר כגון יוני Zn2+ חייבות להיות מווסתות היטב בשל רעילותן התאית. בעבר, הפעילות של מובילי Zn 2+ נמדדה בעקיפין על ידי קביעת רמת הביטוי של הטרנספורטר בריכוזים שונים של Zn2+. זה נעשה על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה, מדידת mRNA ברקמה, או קביעת רמות Zn2+ תאי. עם התפתחותם של חיישני Zn2+ תוך-תאיים, פעילותם של מובילי אבץ נקבעת כיום בעיקר על ידי מתאם שינויים בטרנספורטרים תוך-תאיים Zn 2+, שזוהו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, עם הביטוי של מובילי Zn2+. עם זאת, אפילו כיום, רק מעבדות מעטות מנטרות שינויים דינמיים ב-Zn2+ תוך-תאי ומשתמשות בו כדי למדוד ישירות את הפעילות של מובילי אבץ. חלק מהבעיה היא שמתוך 10 מובילי אבץ ממשפחת ZnT, למעט ZnT10 (מוביל מנגן), רק טרנספורטר אבץ 1 (ZnT1) ממוקם בקרום הפלזמה. לכן, קשה לקשר את פעילות ההובלה לשינויים בריכוז Zn2+ התוך-תאי. מאמר זה מתאר דרך ישירה לקבוע את קינטיקה של הובלת אבץ באמצעות בדיקה המבוססת על צבע פלואורסצנטי ספציפי לאבץ, FluoZin-3. צבע זה נטען לתוך תאי יונקים בצורתו אסטר ולאחר מכן נלכד בציטוזול עקב פעילות די-אסטראז תאית. התאים נטענים ב-Zn 2+ על ידי שימוש בפיריתיון היונופור Zn2+. פעילות ZnT1 מוערכת מהחלק הליניארי של הפחתת הפלואורסצנטיות בעקבות שטיפת התא. הפלואורסצנטיות הנמדדת בעירור של 470 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר פרופורציונלית ל-Zn2+ התוך-תאי החופשי. בחירת התאים המבטאים ZnT1 המתויגים עם mCherry fluorophore מאפשרת ניטור רק של התאים המבטאים את הטרנספורטר. בדיקה זו משמשת לחקר תרומתם של תחומים שונים של חלבון ZnT1 למנגנון ההובלה של ZnT1 אנושי, חלבון טרנסממברנה אאוקריוטי המוציא עודפי אבץ מהתא.

Zinc is an essential trace element in the cellular milieu. It incorporates one-third of all proteins and is involved in various cellular processes, such as catalysis1, transcription2, and structural motifs3. However, despite being redox-inert, high zinc concentrations are toxic to the cell, which is why no mammalian organism has survived without the presence of mechanisms regulating zinc homeostasis. In mammals, three mechanisms are responsible for this process: (1) metallothioneins, which are cytosolic cysteine-rich proteins that bind zinc at a high affinity, thus preventing excess free cytosolic zinc4; (2) Zrt/Irt-like proteins (ZIPs), which are zinc transporters responsible for zinc influx into the cytosol through the plasma membrane or from intracellular organelles4,5,6,7,8; and (3) ZnTs, which are a mammalian subset of the ubiquitous cation diffusion facilitator (CDF) family and are zinc transporters, as they extrude zinc from the cytosol across the plasma membrane or into the intracellular organelles4,5,6,7,8,9. Due to the importance of zinc to cellular metabolism, it is vital to understand cellular zinc dynamics.
Previous methods to assess zinc dynamics depended on assessing the expression levels of mRNA under different zinc conditions by correlating them with cellular zinc measurements of fixed tissues or cells10,11,12. These methods include chemical detection and immunohistochemistry staining. However, these methods yield only indirect measures and, thus, determine only an offline correlation between intracellular zinc concentration and the expression of zinc transporters. Consequently, these methods cannot infer any parameters requiring high temporal resolution.
A more direct measurement of Zn2+ transport uses radioactive isotopes of zinc13. This method relies on the measurement of radiolabeled Zn2+ to monitor zinc transport and its kinetics. However, due to the importance of zinc to cellular homeostasis, multiple cellular processes regulate intracellular zinc concentration. Among these are extracellular binding and several transport systems that work in concert to maintain tight control of intracellular Zn2+ levels. The combination of these processes creates considerable background noise, which makes it difficult to test individual zinc-related transport functions.
This article demonstrates a method to directly monitor the zinc transport rate by measuring the intracellular free zinc concentration using a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. The dye has high specificity for Zn2+ and little interference from other divalent cations, such as calcium. In addition, in its ester form, it enters the cells by nonionic diffusion and is then trapped due to the activity of intracellular di-esterase. Thus, its fluorescence is correlated primarily with the free cytosolic zinc concentration. These experiments were conducted to study the structure-function relationship of zinc transporter 1 (ZnT1), a member of the ZnT family.

מחבר זרקור: חקר ויסות אבץ תאי באמצעות פונקציונליות ZnT1 

אפיון מובילי אבץ של יונקים באמצעות בדיקת הובלת אבץ חוץ גופית

My research focuses on the structure-function relationship of mammalian zinc transporters, with special emphasis on the regulation mechanism. Due to the importance of zinc ion to cellular function, it is challenging to obtain accurate measurement of cellular zinc dynamics. Our protocol addresses the low signal-to-noise ratio and low temporal resolution of zinc dynamics.This method allows testing of zinc influx across the cell membrane, with high temporal resolution and considerably less background noise and cross-interactions by other divalent cations. We found that the unstructured extension of the mammalian transporter ZnT1 one C-terminal domain is not involved in the zinc transport function. This allows researchers to focus on other domains of the ZnT1 protein for zinc transport regulation.

ZnT1 הוא טרנספורטר אבץ יונקים הממוקם על קרום פלזמה התא13. הוא חבר במשפחת החלבונים CDF (cation diffusion facilitator) המזרים אבץ מהציטוזול למילייה14 החוץ-תאי. ל-ZnT1 ארכיטקטורה דו-תחומית: תחום טרנסממברנה, המוביל את היונים על פני הממברנה, ותחום C-terminal14. שלא כמו חלבוני CDF ידוע?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality at JoVE.com

הובלת אבץ הוכחה כמאתגרת למדידה בשל הקשרים הסיבתיים החלשים לתפקוד החלבונים והרזולוציה הטמפורלית הנמוכה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור, ברזולוציה טמפורלית גבוהה, של שחול Zn 2+ מתאים חיים על ידי שימוש בצבע פלואורסצנטי רגיש Zn 2+, ובכך מספק מדד ישיר של Zn2+ efflux.

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

המחקר שלי מתמקד ביחסי מבנה-תפקוד של מובילי אבץ ביונקים, עם דגש מיוחד על מנגנון הבקרה. בשל חשיבותו של יון אבץ לתפקוד התאים, קשה להשיג מדידה מדויקת של דינמיקת האבץ בתאים. הפרוטוקול שלנו מתייחס ליחס אות לרעש נמוך ורזולוציה טמפורלית נמוכה של דינמיקת אבץ.שיטה זו מאפשרת בדיקה של זרימת אבץ על פני קרום התא, ברזולוציה טמפורלית גבוהה והרבה פחות רעשי רקע ואינטראקציות צולבות על ידי קטיונים דו-ערכיים אחרים. מצאנו כי ההרחבה הבלתי מובנית של טרנספורטר היונקים ZnT1 תחום C-terminal אחד אינה מעורבת בפונקציית הובלת האבץ. זה מאפשר לחוקרים להתמקד בתחומים אחרים של חלבון ZnT1 לוויסות הובלת אבץ.

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

795 Views.  Ben-Gurion University. המחקר שלי מתמקד ביחסי מבנה-תפקוד של מובילי אבץ ביונקים, עם דגש מיוחד על מנגנון הבקרה. בשל חשיבותו של יון אבץ לתפקוד התאים, קשה להשיג מדידה מדויקת של דינמיקת האבץ בתאים. הפרוטוקול שלנו מתייחס ליחס אות לרעש נמוך ורזולוציה טמפורלית נמוכה של דינמיקת אבץ.שיטה זו מאפשרת בדיקה ...

Video: מחבר זרקור: חקר ויסות אבץ תאי באמצעות פונקציונליות ZnT1 

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Zinc-Specific Staining of Transfected HEK293T Cells

Begin by analyzing transfected HEK293T cells using an inverted fluorescence microscope. Once the cells are focused using bright-field light, switch to fluorescent mCherry excitation wavelength of 587 nanometers and emission wavelengths of 610 nanometers. After turning off the bright-field light, check for the fluorescence of the cells to confirm the expression of ZnT1 mCherry.To prepare dye-loading solution, take four microliters of zinc-specific fluorescent dye solution. Then add four microliters of 10%pluronic acid. Mix the solution by pipetting up and down, and transfer it to a 1.5-milliliter tube.Add 750 microliters of washing solution into the prepared solution and vortex the tube vigorously. Again, add 750 microliters of wash solution. Once vortexed, add 750 microliters of this solution into two wells of a new six-well culture plate and cover it with aluminum foil.Using tweezers, transfer a 13-millimeter cover slip from the previously cultured HEK293T cell plate into a six-well plate. After covering the plate with foil, gently shake it for 15 to 20 minutes and replace the dye-loading solution with the prepared washing solution. Once the plate is covered, shake it again for 20 minutes.

צביעה ספציפית לאבץ של תאי HEK293T נגועים

Sample Preparation and Fluorescence Measurement of Stained Transfected HEK293T Cells

To begin, turn on the microscope, light source, camera, and suction system. For washing the perfusion system, use Ringer's solution in the first chamber and Ringer's zinc solution supplemented with pyrithione in the second chamber. After closing the tap, fill the chambers with the same solutions.To begin sample preparation, place the perfusion chamber with the narrow side of the groove facing up and apply a sealing silicone around the groove. Then, using a fine tweezer, transfer a 13-millimeter coverslip from the washing solution on top of the groove with cells facing down. Place a 22-millimeter coverslip on top of the 13-millimeter coverslip and tighten it using the tweezer, taking care not to crack the coverslips.Flip the chamber and press it to release the liquids. Then, fill the groove with 100 microliters of Ringer's washing solution and press again, ensuring no leakage. Mount and secure the perfusion chamber onto the platform.Then, attach the perfusion and suction tubes for perfusion over the cells in the groove. Change the perfusion rate to approximately two milliliters per minute and turn on Ringer's solution perfusion. For measurements, open the imaging software.Set the microscope magnification to 10X using the left side button of the microscope. After choosing Live View, use the joystick to move the platform and focus on the cells in the groove. Select the appropriate wavelength for mCherry.Once the cells are focused, move the platform for the selection of appropriate cell patches. Select the Draw ROIs dropdown menu. Choose Draw Circular ROIs and draw ROIs on cell clusters with the mCherry-expressing cells.Create new ROIs beyond the first by holding down the Shift button and then by pressing and dragging the existing ROIs. Select Draw Square Background ROI from the dropdown menu and adjust the location and size of the background ROI where cells are not present. After ensuring the absence of cells in the background ROI, go to the ND Acquisition tab.Select the Wavelength subtab and mark its checkbox. Ensure that the checkbox for GFP wavelength is also marked. Click on the Time subtab and define the measurement interval as every five seconds and duration as 30 minutes.On the microscope panel, press the On to enable the Perfect Focus System, or PFS. Under ND Acquisition, ensure PFS on is ticked. Adjust the focus and click Run now.Start baseline period measurement for 90 seconds using Ringer's solution perfusion. After 90 seconds, switch from the Ringer's solution perfusion to the Ringer's zinc solution perfusion, and click the red flag on the bottom right of the main interface panel once the fluorescence rise starts to saturate. Change back to perfusion with Ringer's solution until the experiment time expires.To export the data with baseline subtraction, press the Background Correction button and view the changes in the ND Acquisition window. Click the Export button to save the data in the desired location. An increase in fluorescence resulted from increased intracellular zinc concentration, while a decrease indicated the activity of ZnT-1 transporting zinc across the cell membrane.The wild type ZnT-1 had a smoother fluorescence curve than the mutant, relating to the variability in the cellular responses to zinc load. A box plot comparing the activities of wild-type and delta USCTD showed similar average transport rates, indicating a lack of difference between the wild type and the mutant. However, the difference in the spread may indicate a functional difference.