راز زاريفاخ مدعوم من صندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 163/22). يتم دعم تومر إيلي بن يوسف وآري موران من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة رقم 2047/20). نود أن نشكر دانيال جيتلر ومجموعته في جامعة بن غوريون على تعاونهم ودعمهم وخبرتهم.

1. نقل الخلايا
<ol><li>HEK293T الخلايا المستنبتة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 2 mM L-glutamine ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد) في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 حتى التقائه على صفيحة 10 سم (8.8 × 106 خلايا إجمالية).</li>
	<li>ضع غطاء واحد 13 مم في كل بئر من آبار صفيحة 12 بئرا. تمييع 0.44 × 106 خلايا تربسين من الخطوة 1.1 في 12 مل من DMEM الكامل. تخلط جيدا عن طريق سحب اللأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات. املأ كل بئر ب 1 مل من المحلول المختلط. تنمو في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.</li>
	<li>استبدل DMEM الكامل في كل بئر ب 1 مل من DMEM الخالي من المصل (انظر جدول المواد) في كل بئر. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب كما في الخطوة 1.1.</li>
	<li>لكل بئر نقل ، قم بتخفيف 1 ميكروغرام من بلازميد pAAV2 الذي يحتوي على البروتين محل الاهتمام الموسوم ببروتين الفلورسنت mCherry (الملف التكميلي 1) في 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل في أنبوب 1.5 مل.</li>
	<li>أضف 3 ميكروغرام من البولي إيثيلين (PEI ، انظر جدول المواد) إلى 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل لكل عملية نقل ، مع كل نقل في أنبوب مختلف سعة 1.5 مل. يجب أن تكون نسبة البلازميد: PEI 1: 3 (μg: μg).</li>
	<li>دوامة كلا الأنبوبين من الخطوة 1.4 والخطوة 1.5 لمدة 10 ثوان ، واتركيها ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل.</li>
	<li>امزج جزءا واحدا (100 ميكرولتر لكل بئر) من محلول الحمض النووي من الخطوة 1.4 مع جزء واحد (100 ميكرولتر لكل بئر) من محلول PEI من الخطوة 1.5. دوامة الحل النهائي لمدة 10 ثوان ، واتركه يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل ولمدة تصل إلى 6 ساعات.</li>
	<li>خذ لوحة 12 بئرا من الحاضنة. دوامة الحل النهائي من الخطوة 1.7 ، وإضافة 200 ميكرولتر إلى كل من الآبار في لوحة 12 بئر من الخطوة 1.3. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب (الخطوة 1.1).</li>
	<li>بعد 3 ساعات ، استبدل الوسط في كل بئر ب 1 مل من DMEM الكامل. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة المرطب كما في الخطوة 1.1.</li>
	<li>بعد يومين ، خذ مزرعة الخلايا المنقولة من حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 ، وضعها على مجهر مضان مقلوب باستخدام تكبير 10x.</li>
	<li>باستخدام عجلة التركيز المجهرية ، ركز على الخلايا أثناء استخدام ضوء برايتفيلد.</li>
	<li>قم بالتبديل إلى الأطوال الموجية للإثارة الفلورية mCherry (587 نانومتر) والانبعاثات (610 نانومتر) ، وأطفئ ضوء برايتفيلد. تحقق من مضان الخلايا لتأكيد تعبير ZnT1 mCherry.</li>
	<li>تحضير محلول تحميل الصبغة.<ol><li>خذ حصة من 4 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت الخاصة بالزنك (انظر جدول المواد) في شكل إستر أسيتوكسي ميثيل (AM) ، مذاب في DMSO (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، من مخزون محمي من الضوء مخزن في مجمد -20 درجة مئوية. يسمح هذا النموذج للصبغة بدخول الخلية عبر غشاء البلازما عن طريق الانتشار البسيط.</li>
		<li>أضف 4 ميكرولتر من حمض البلورونيك 10٪ (أو 2 ميكرولتر من حمض البلورونيك 20٪ ، انظر جدول المواد) إلى القسمة من الخطوة 1.13.1. امزج المحلول جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات ، ثم أضف كل 8 ميكرولتر إلى أنبوب سعة 1.5 مل.</li>
		<li>أضف 750 ميكرولتر من محلول رينغر (المحضر داخليا ، انظر جدول المواد للتركيب) المكمل ب 1 مجم / مل (~ 0.1٪) من ألبومين مصل الأبقار إلى الأنبوب من الخطوة 1.13.2 ، والدوامة بقوة. أضف 750 ميكرولتر أخرى من نفس المحلول ، ودوامة مرة أخرى لضمان أقصى قدر من الخلط.</li>
	</ol></li>
	<li>أضف 750 ميكرولتر من المحلول النهائي من الخطوة 1.13.3 إلى بئرين في لوحة استزراع جديدة مكونة من 6 آبار. مع تغطية رقائق الألومنيوم. ملاحظة: لتجنب التبييض ، يتم دائما تغطية اللوحة المكونة من 6 آبار بورق الألمنيوم من هذه الخطوة.</li>
	<li>باستخدام ملقط ناعم ، خذ ما يصل إلى أربع أغطية مكررة من لوحة زراعة الخلايا المنقولة ، وضعها في أول بئر مملوء (حتى أربع شرائح لكل بئر) من اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار من الخطوة 1.14. كرر هذه العملية للبئر الثانية المملوءة. ملاحظة: يجب أن تكون جميع أغطية الأغطية في نفس البئر المملوءة من نفس الحالة. ومع ذلك ، يمكن أن يحتوي كل بئر على ظروف مختلفة.</li>
	<li>يغطى بورق الألمنيوم ويهز برفق لمدة 15-20 دقيقة.</li>
	<li>قم بإزالة محلول تحميل الصبغة واستبدله بمحلول غسيل جديد من ألبومين Ringer's plus ، كما هو مستخدم في الخطوة 1.13.3. مع تغطية رقائق الألومنيوم. اتركيه ليهز مرة أخرى لمدة 20 دقيقة. هذا يسمح بانقسام إستر AM بواسطة الإسترازات داخل الخلايا.</li>
</ol>2. إعداد المجهر
<ol><li>رتب الأدوات اللازمة (انظر جدول المواد) كما ذكرنا: مجهر مضان مقلوب قادر على اكتشاف GFP و mCherry fluorophores ، ونظام نضح يسمح بالتبديل بين محلولين على الأقل ، ونظام شفط ، وغرفة تروية.</li>
	<li>قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء والكاميرا. قم بتشغيل نظام الشفط.</li>
	<li>اغسل نظام التروية. اغسل الحجرة الأولى بمحلول رينغر والغرفة الثانية بمحلول رينغر الذي يحتوي على محلول زنك 7 ميكرومتر مكمل ببيريثيون 7 ميكرومتر (أيونوفور الزنك ، انظر جدول المواد). لتجنب فقاعات الهواء أو الفجوات ، اترك بعض السوائل في كل غرفة. ملاحظة: نظرا لأن كلتا الحاويتين متصلتان بنفس الأنبوب المتصل بغرفة التروية ، تأكد دائما من غسل الجزء المشترك بمحلول Ringer.</li>
	<li>أغلق الصنابير ، واملأ الغرف المناسبة بمحلول Ringer ومحلول الزنك من Ringer ، كما في الخطوة 2.3.</li>
</ol>3. إعداد عينة
<ol><li>خذ غرفة التروية ، وضعها مع الجانب الضيق من الأخدود متجها لأعلى. ملاحظة: الأخدود عبارة عن ثقب في منتصف غرفة التروية. يسمح لسائل التروية بالوصول إلى الخلايا. جانب واحد من الأخدود ضيق ، والجانب الآخر واسع.</li>
	<li>ضع سيليكون مانع للتسرب (انظر جدول المواد) حول الأخدود. نظف أي سيليكون مانع للتسرب من الأخدود باستخدام طرف ماصة. ملاحظة: تأكد من وجود ختم سيليكون كاف حول الأخدود لإغلاق غطاء 22 مم.</li>
	<li>باستخدام ملقط ناعم ، خذ غطاء من محلول الغسيل ، وضعه أعلى الأخدود مع توجيه الخلايا لأسفل. بهذه الطريقة، ستتعرض الخلايا للمحلول الذي يثقب الأخدود أثناء التجربة.</li>
	<li>ضع غطاء 22 مم فوق غطاء الغطاء مقاس 13 مم ، وقم بإحكام ربطه باستخدام الملقط. احرص على عدم تكسير الغطاء.</li>
	<li>اقلب الحجرة واضغط عليها لتحرير جميع السوائل الموجودة. املأ الأخدود ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل Ringer ، واضغط مرة أخرى لضمان عدم حدوث تسرب. ملاحظة: إذا تم اكتشاف تسرب ، فقم بتطبيق عامل مانع للتسرب في موقع التسرب ، وأعد الاختبار.</li>
	<li>قم بتركيب حجرة التروية على المنصة وتأمينها. ضع أنابيب التروية والشفط للسماح بالتروية فوق الخلايا الموجودة في الأخدود.</li>
	<li>قم بتغيير معدل التروية إلى حوالي 2 مل / دقيقة ، وقم بتشغيل تروية محلول رينجر. تأكد من أن نظام التروية يعمل بدون تسرب أو امتداد.</li>
</ol>4. إعداد القياس
<ol><li>افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج على الرمز. قم بتسجيل الدخول باستخدام بيانات الاعتماد ذات الصلة. اختر الكاميرا المرفقة، واضغط على موافق.</li>
	<li>اضبط تكبير المجهر على 10x باستخدام الزر الموجود على الجانب الأيسر من المجهر.</li>
	<li>عند اختيار العرض المباشر واستخدام عصا التحكم ، حرك النظام الأساسي للتركيز على الخلايا الموجودة في الأخدود.</li>
	<li>أثناء تشغيل التروية ، أطفئ الأنوار وقم بتغيير الطول الموجي إلى mCherry بالضغط على الزر المخصص في الواجهة. اضبط التركيز باستخدام عجلة التركيز المجهرية.</li>
	<li>بمجرد تركيز المجهر على الخلايا ، حرك المنصة باستخدام عصا التحكم للسماح باختيار بقع الخلايا المناسبة. ملاحظة: تعتبر المنطقة المناسبة منطقة بها 10 خلايا على الأقل لعائد الاستثمار ومنطقة فارغة للخلفية.</li>
	<li>حدد القائمة المنسدلة تشغيل /إيقاف تشغيل عائد الاستثمار ، واختر رسم عائد استثمار دائري.</li>
	<li>ارسم عائد استثمار لمجموعات الخلايا باستخدام الخلايا المعبرة عن mCherry (يشير إلى تعبير ZnT1).</li>
	<li>من شريط الأدوات نفسه مثل الخطوة 4.6 ، انقر فوق الزر تشغيل / إيقاف تشغيل عائد الاستثمار في الخلفية ، واضبط موقع وحجم عائد الاستثمار في الخلفية على منطقة لا تحتوي على خلايا على الإطلاق.<ol><li>تحقق من الأطوال الموجية mCherry و EGFP للتأكد من عدم وجود خلايا في عائد الاستثمار المحدد في الخلفية. ملاحظة: تم تعديل الأطوال الموجية بحيث استخدم mCherry طولا موجيا للإثارة يبلغ 520 نانومتر وطولا موجيا للانبعاث يبلغ 610 نانومتر واستخدم EGFP طولا موجيا للإثارة يبلغ 470 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 520 نانومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>حدد علامة التبويب الفرعية الطول الموجي (λ ). حدد خانة الاختيار الخاصة به ، وتأكد من وجود الطول الموجي ل GFP ووضع علامة على خانة الاختيار الخاصة به. إذا لم يكن كذلك ، قم بإضافته ووضع علامة عليه.</li>
	<li>حدد علامة التبويب الفرعية المدة . حدد الفاصل الزمني للقياس على أنه كل 5 ثوان ، وقم بتغيير عدد الفواصل الزمنية لتناسب مدة التجربة.</li>
	<li>في قسم التركيز على لوحة المجهر أسفل العدسة ، انقر فوق الزر تشغيل لتمكين نظام التركيز المثالي (PFS).</li>
	<li>باستخدام عجلة التركيز PFS ، اضبط التركيز. في واجهة البرنامج ، ضمن الاستحواذ على ND ، تأكد من وضع علامة على PFS .</li>
	<li>انقر فوق تشغيل الآن.</li>
</ol>5. الإجراء التجريبي
<ol><li>ابدأ بقياس فترة خط الأساس 90 ثانية باستخدام نضح محلول رينغر.</li>
	<li>بعد انتهاء فترة خط الأساس، قم بإيقاف تشغيل نضح محلول رينغر، ثم قم بتشغيل نضح محلول الزنك الخاص ب Ringer. حدد تبديل الحل بالنقر فوق العلم الأحمر في أسفل يمين لوحة الواجهة الرئيسية. من المتوقع أن يظهر ارتفاع في التألق.</li>
	<li>بمجرد أن يبدأ ارتفاع التألق في التشبع ، قم بالتغيير مرة أخرى إلى التروية باستخدام محلول رينجر. قم بإيقاف تشغيل نضح محلول الزنك في Ringer ، ثم قم بتشغيل نضح محلول Ringer.</li>
	<li>انتظر حتى انتهاء وقت التجربة. من المتوقع حدوث انخفاض ملحوظ وثابت في التألق إذا كان ZnT1 يعمل بشكل صحيح.</li>
</ol>6. تصدير البيانات
<ol><li>لتصدير البيانات باستخدام طرح خط الأساس ، اضغط على الزر طرح خط الأساس ، واعرض التغييرات في "نافذة اكتساب ND".</li>
	<li>انقر فوق الزر تصدير في واجهة البرنامج في "نافذة اكتساب ND". سيتم فتح ورقة بيانات Excel. حفظ في الموقع المطلوب.</li>
</ol>7. تحليل البيانات
<ol><li>لكل عائد استثمار ، قم بإنشاء متوسط مضان خط الأساس من أول 90-100 ثانية.</li>
	<li>عبر عن التألق المحسوب لكل عائد استثمار كنسبة مئوية من خلفية عائد الاستثمار هذا.</li>
	<li>قم بإنشاء متوسط صف لجميع عائد الاستثمار ، وارسم النتيجة كرسم بياني خطي. هذا يخلق متوسط جميع عائد الاستثمار كدالة للوقت.</li>
	<li>باستخدام وظيفة الملاءمة الخطية، حدد المعدل الأولي للانخفاض في التألق بعد الغسيل بمحلول رينغر. ترتبط قيمة ميل المعادلة بمعدل النقل.</li>
</ol>

التحقيق في آلية نقل الزنك في خلايا الثدييات باستخدام مقايسة FluoZin-3

<ol>
	<li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase.">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li><li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron,+zinc,+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells.">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li><li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Biochemistry:+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life.">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li><li>Kimura, T., Kambe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+metallothionein+and+ZIP+and+ZnT+transporters:+An+overview+and+perspective.">The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).</li><li>Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+ZIP+and+ZnT+zinc+transporters+in+human+health+and+diseases.">Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).</li><li>Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological,+biochemical,+and+molecular+roles+of+zinc+transporters+in+zinc+homeostasis+and+metabolism.">The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).</li><li>Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporters+as+potential+therapeutic+targets:+An+updated+review.">Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).</li><li>Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporters+and+their+functional+integration+in+mammalian+cells.">Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).</li><li>Huang, L., Tepaamorndech, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC30+family+of+zinc+transporters+-+A+review+of+current+understanding+of+their+biological+and+pathophysiological+roles.">The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).</li><li>Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+zinc+transporter+protein-1+(ZnT-1)+in+the+brain+of+subjects+with+mild+cognitive+impairment,+early,+and+late-stage+Alzheimer's+disease.">Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease.</a> Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).</li><li>Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+zinc+transporter+proteins+ZnT-1,+ZnT-4+and+ZnT-6+in+preclinical+Alzheimer's+disease+brain.">Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain.</a> Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).</li><li>Tsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+zinc+transporter+gene,+ZnT-1,+is+induced+after+transient+forebrain+ischemia+in+the+gerbil.">Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).</li><li>Palmiter, R. d., Findley, S. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+mammalian+zinc+transporter+that+confers+resistance+to+zinc.">Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc.</a> The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).</li><li>Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+overview+of+the+zinc+transporters+in+the+cation+diffusion+facilitator+family.">A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).</li><li>Shapiro, S. S., Wilk, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+variance+test+for+normality+(complete+samples).">An analysis of variance test for normality (complete samples).</a> Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).</li><li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+a+test+of+whether+one+of+two+random+variables+is+stochastically+larger+than+the+other.">On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li><li>Darling, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov,+Cramer-von+Mises+tests.">The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+zinc+in+living+cells.:+A+new+generation+of+sensitive+and+selective+fluorescent+probes.">Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes.</a> Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).</li><li>Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mitochondrial+fluorescent+zinc+sensor.">A new mitochondrial fluorescent zinc sensor.</a> Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).</li><li>Hessels, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eZinCh-2:+A+versatile,+genetically+encoded+FRET+sensor+for+cytosolic+and+intraorganelle+Zn2++imaging.">eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging.</a> ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).</li><li>S&#225;nchez-Mart&#237;n, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsphere-based+real-time+calcium+sensing.">Microsphere-based real-time calcium sensing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).</li><li>Namdarghanbari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+the+zinc+sensor+FluoZin-3+with+Zn7-metallothionein:+Inquiry+into+the+existence+of+a+proposed+weak+binding+site.">Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).</li><li>Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+intracellular+free+calcium+and+zinc+using+fura-2FF+and+FluoZin-3.">Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3.</a> Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تسمح الطريقة الموصوفة أعلاه بالقياس المباشر لتركيز الزنك داخل الخلايا بدقة زمنية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يمكن لهذه الطريقة التي تتضمن مراقبة التغييرات في Zn2+ داخل الخلايا أن تقلل بشكل كبير من ضوضاء الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انتقائية الصبغة للزنك تقضي على التفاعلات ا...

الزنك هو عنصر تتبع أساسي في الوسط الخلوي. وهو يشتمل على ثلث جميع البروتينات ويشارك في عمليات خلوية مختلفة ، مثل الحفز1 والنسخ2 والزخارف الهيكلية3. ومع ذلك ، على الرغم من كونها خاملة الأكسدة والاختزال ، فإن تركيزات الزنك العالية سامة للخلية ، وهذا هو السبب في عدم بقاء أي كائن حي في الثدييات دون وجود آليات تنظم توازن الزنك. في الثدييات ، هناك ثلاث آليات مسؤولة عن هذه العملية: (1) ميتالوثيونين ، وهي بروتينات غنية بالسيستين الخلوي تربط الزنك بتقارب عال ، وبالتالي تمنع الزنك الخلوي الحرالزائد 4 ؛ (2) البروتينات الشبيهة ب Zrt / IRT (ZIPs) ، وهي ناقلات الزنك المسؤولة عن تدفق الزنك إلى السيتوسول من خلال غشاء البلازما أو من العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8 ؛ و (3) ZnTs ، وهي مجموعة فرعية من الثدييات من عائلة ميسر الانتشار الكاتيوني في كل مكان (CDF) وهي ناقلات الزنك ، لأنها تقذف الزنك من السيتوسول عبر غشاء البلازما أو إلى العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8،9. نظرا لأهمية الزنك في التمثيل الغذائي الخلوي ، من الضروري فهم ديناميكيات الزنك الخلوية.
اعتمدت الطرق السابقة لتقييم ديناميكيات الزنك على تقييم مستويات التعبير عن mRNA في ظل ظروف الزنك المختلفة من خلال ربطها بقياسات الزنك الخلوية للأنسجة أو الخلايا الثابتة10،11،12. وتشمل هذه الطرق الكشف الكيميائي وتلطيخ الكيمياء المناعية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تسفر إلا عن مقاييس غير مباشرة ، وبالتالي ، تحدد فقط وجود علاقة غير متصلة بالإنترنت بين تركيز الزنك داخل الخلايا والتعبير عن ناقلات الزنك. وبالتالي ، لا يمكن لهذه الطرق استنتاج أي معلمات تتطلب دقة زمنية عالية.
يستخدم القياس المباشر لنقل Zn2+ النظائر المشعة للزنك13. تعتمد هذه الطريقة على قياس Zn2+ المشع لمراقبة انتقال الزنك وحركيته. ومع ذلك، نظرا لأهمية الزنك في الاتزان الخلوي، تنظم العمليات الخلوية المتعددة تركيز الزنك داخل الخلايا. من بينها الربط خارج الخلية والعديد من أنظمة النقل التي تعمل بشكل متضافر للحفاظ على رقابة صارمة على مستويات Zn2+ داخل الخلايا. يؤدي الجمع بين هذه العمليات إلى حدوث ضوضاء كبيرة في الخلفية ، مما يجعل من الصعب اختبار وظائف النقل الفردية المتعلقة بالزنك.
توضح هذه المقالة طريقة لمراقبة معدل نقل الزنك مباشرة عن طريق قياس تركيز الزنك الحر داخل الخلايا باستخدام صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. تتميز الصبغة بخصوصية عالية ل Zn2+ وتداخل قليل من الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، مثل الكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، في شكل استر ، يدخل الخلايا عن طريق الانتشار غير الأيوني ثم يتم احتجازه بسبب نشاط ثنائي الإستراز داخل الخلايا. وبالتالي ، يرتبط مضانه في المقام الأول مع تركيز الزنك الخلوي الحر. أجريت هذه التجارب لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة لناقل الزنك 1 (ZnT1) ، وهو عضو في عائلة ZnT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm coverslips</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>111530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm cover slides</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>101050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>bioWorld</td>
			<td>22070008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Glentham Life Science</td>
			<td>GC6947</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#8217;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH</td>
			<td>Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-55-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F24195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 0.8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HEPES10</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo 5.5 sCMOS camera</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DC-152Q-FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>163823</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrithione</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3261</td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>W4 64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190305</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 120 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31665</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mammalian zinc transporters using an in vitro zinc transport assay

يجب تنظيم المعادن الانتقالية مثل أيونات Zn2+ بإحكام بسبب سميتها الخلوية. في السابق ، تم قياس نشاط ناقلات Zn 2+ بشكل غير مباشر عن طريق تحديد مستوى تعبير الناقل تحت تركيزات مختلفة من Zn2+. تم ذلك عن طريق استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو قياس mRNA في الأنسجة ، أو تحديد مستويات Zn2+ الخلوية. مع تطور مستشعرات Zn 2+ داخل الخلايا ، يتم تحديد أنشطة ناقلات الزنك حاليا بشكل أساسي من خلال ربط التغييرات في Zn 2+ داخل الخلايا ، والتي تم اكتشافها باستخدام مجسات الفلورسنت ، مع التعبير عن ناقلات Zn2+. ومع ذلك ، حتى اليوم ، هناك عدد قليل فقط من المختبرات التي تراقب التغيرات الديناميكية في Zn2+ داخل الخلايا وتستخدمها لقياس نشاط ناقلات الزنك مباشرة. جزء من المشكلة هو أنه من بين 10 ناقلات الزنك من عائلة ZnT ، باستثناء ZnT10 (ينقل المنغنيز) ، يتم توطين ناقل الزنك 1 (ZnT1) فقط في غشاء البلازما. لذلك ، من الصعب ربط نشاط النقل بالتغيرات في تركيز Zn2+ داخل الخلايا. توضح هذه المقالة طريقة مباشرة لتحديد حركية نقل الزنك باستخدام مقايسة تعتمد على صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. يتم تحميل هذه الصبغة في خلايا الثدييات في شكل استر ثم يتم احتجازها في السيتوسول بسبب نشاط ثنائي الإستراز الخلوي. يتم تحميل الخلايا ب Zn 2+ باستخدام بيريثيون الأيونوفور Zn2+. يتم تقييم نشاط ZnT1 من الجزء الخطي من الانخفاض في التألق بعد غسل الخلية. يتناسب التألق المقاس عند إثارة 470 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر مع Zn2+ الحر داخل الخلايا. يسمح اختيار الخلايا التي تعبر عن ZnT1 الموسومة بفلوروفور mCherry بمراقبة الخلايا التي تعبر عن الناقل فقط. يستخدم هذا الفحص للتحقيق في مساهمة المجالات المختلفة لبروتين ZnT1 في آلية نقل ZnT1 البشري ، وهو بروتين عبر غشاء حقيقي النواة يقذف الزنك الزائد من الخلية.

Zinc is an essential trace element in the cellular milieu. It incorporates one-third of all proteins and is involved in various cellular processes, such as catalysis1, transcription2, and structural motifs3. However, despite being redox-inert, high zinc concentrations are toxic to the cell, which is why no mammalian organism has survived without the presence of mechanisms regulating zinc homeostasis. In mammals, three mechanisms are responsible for this process: (1) metallothioneins, which are cytosolic cysteine-rich proteins that bind zinc at a high affinity, thus preventing excess free cytosolic zinc4; (2) Zrt/Irt-like proteins (ZIPs), which are zinc transporters responsible for zinc influx into the cytosol through the plasma membrane or from intracellular organelles4,5,6,7,8; and (3) ZnTs, which are a mammalian subset of the ubiquitous cation diffusion facilitator (CDF) family and are zinc transporters, as they extrude zinc from the cytosol across the plasma membrane or into the intracellular organelles4,5,6,7,8,9. Due to the importance of zinc to cellular metabolism, it is vital to understand cellular zinc dynamics.
Previous methods to assess zinc dynamics depended on assessing the expression levels of mRNA under different zinc conditions by correlating them with cellular zinc measurements of fixed tissues or cells10,11,12. These methods include chemical detection and immunohistochemistry staining. However, these methods yield only indirect measures and, thus, determine only an offline correlation between intracellular zinc concentration and the expression of zinc transporters. Consequently, these methods cannot infer any parameters requiring high temporal resolution.
A more direct measurement of Zn2+ transport uses radioactive isotopes of zinc13. This method relies on the measurement of radiolabeled Zn2+ to monitor zinc transport and its kinetics. However, due to the importance of zinc to cellular homeostasis, multiple cellular processes regulate intracellular zinc concentration. Among these are extracellular binding and several transport systems that work in concert to maintain tight control of intracellular Zn2+ levels. The combination of these processes creates considerable background noise, which makes it difficult to test individual zinc-related transport functions.
This article demonstrates a method to directly monitor the zinc transport rate by measuring the intracellular free zinc concentration using a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. The dye has high specificity for Zn2+ and little interference from other divalent cations, such as calcium. In addition, in its ester form, it enters the cells by nonionic diffusion and is then trapped due to the activity of intracellular di-esterase. Thus, its fluorescence is correlated primarily with the free cytosolic zinc concentration. These experiments were conducted to study the structure-function relationship of zinc transporter 1 (ZnT1), a member of the ZnT family.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تنظيم الزنك الخلوي من خلال وظائف ZnT1 

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

My research focuses on the structure-function relationship of mammalian zinc transporters, with special emphasis on the regulation mechanism. Due to the importance of zinc ion to cellular function, it is challenging to obtain accurate measurement of cellular zinc dynamics. Our protocol addresses the low signal-to-noise ratio and low temporal resolution of zinc dynamics.This method allows testing of zinc influx across the cell membrane, with high temporal resolution and considerably less background noise and cross-interactions by other divalent cations. We found that the unstructured extension of the mammalian transporter ZnT1 one C-terminal domain is not involved in the zinc transport function. This allows researchers to focus on other domains of the ZnT1 protein for zinc transport regulation.

ZnT1 هو ناقل زنك للثدييات يقع على غشاء بلازما الخلية13. وهو عضو في عائلة بروتين ميسر الانتشار الكاتيوني (CDF) الذي يقذف الزنك من السيتوسول إلى ميليو14 خارج الخلية. يحتوي ZnT1 على بنية ذات مجالين: المجال عبر الغشاء ، الذي ينقل الأيونات عبر الغشاء ، والمجال الطرفي C<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality at JoVE.com

ثبت أن نقل الزنك يمثل صعوبة في القياس بسبب ضعف الروابط السببية لوظيفة البروتين والدقة الزمنية المنخفضة. يصف هذا البروتوكول طريقة للمراقبة ، بدقة زمنية عالية ، قذف Zn 2+ من الخلايا الحية باستخدام صبغة فلورية حساسة ل Zn 2+ ، وبالتالي توفير قياس مباشر لتدفق Zn2+.

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

يركز بحثي على العلاقة بين البنية والوظيفة لناقلات الزنك في الثدييات ، مع التركيز بشكل خاص على آلية التنظيم. نظرا لأهمية أيون الزنك للوظيفة الخلوية ، من الصعب الحصول على قياس دقيق لديناميكيات الزنك الخلوية. يعالج بروتوكولنا نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة والدقة الزمنية المنخفضة لديناميكيات الزنك.تسمح هذه الطريقة باختبار تدفق الزنك عبر غشاء الخلية ، مع دقة زمنية عالية وضوضاء خلفية أقل بكثير وتفاعلات متقاطعة بواسطة الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى. وجدنا أن الامتداد غير المنظم لناقل الثدييات ZnT1 واحد C-terminal المجال لا يشارك في وظيفة نقل الزنك. هذا يسمح للباحثين بالتركيز على مجالات أخرى من بروتين ZnT1 لتنظيم نقل الزنك.

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

795 Views.  Ben-Gurion University. يركز بحثي على العلاقة بين البنية والوظيفة لناقلات الزنك في الثدييات ، مع التركيز بشكل خاص على آلية التنظيم. نظرا لأهمية أيون الزنك للوظيفة الخلوية ، من الصعب الحصول على قياس دقيق لديناميكيات الزنك الخلوية. يعالج بروتوكولنا نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة والدقة الزمنية...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تنظيم الزنك الخلوي من خلال وظائف ZnT1 

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Zinc-Specific Staining of Transfected HEK293T Cells

Begin by analyzing transfected HEK293T cells using an inverted fluorescence microscope. Once the cells are focused using bright-field light, switch to fluorescent mCherry excitation wavelength of 587 nanometers and emission wavelengths of 610 nanometers. After turning off the bright-field light, check for the fluorescence of the cells to confirm the expression of ZnT1 mCherry.To prepare dye-loading solution, take four microliters of zinc-specific fluorescent dye solution. Then add four microliters of 10%pluronic acid. Mix the solution by pipetting up and down, and transfer it to a 1.5-milliliter tube.Add 750 microliters of washing solution into the prepared solution and vortex the tube vigorously. Again, add 750 microliters of wash solution. Once vortexed, add 750 microliters of this solution into two wells of a new six-well culture plate and cover it with aluminum foil.Using tweezers, transfer a 13-millimeter cover slip from the previously cultured HEK293T cell plate into a six-well plate. After covering the plate with foil, gently shake it for 15 to 20 minutes and replace the dye-loading solution with the prepared washing solution. Once the plate is covered, shake it again for 20 minutes.

تلطيخ الخلايا HEK293T المنقولة بالزنك

Sample Preparation and Fluorescence Measurement of Stained Transfected HEK293T Cells

To begin, turn on the microscope, light source, camera, and suction system. For washing the perfusion system, use Ringer's solution in the first chamber and Ringer's zinc solution supplemented with pyrithione in the second chamber. After closing the tap, fill the chambers with the same solutions.To begin sample preparation, place the perfusion chamber with the narrow side of the groove facing up and apply a sealing silicone around the groove. Then, using a fine tweezer, transfer a 13-millimeter coverslip from the washing solution on top of the groove with cells facing down. Place a 22-millimeter coverslip on top of the 13-millimeter coverslip and tighten it using the tweezer, taking care not to crack the coverslips.Flip the chamber and press it to release the liquids. Then, fill the groove with 100 microliters of Ringer's washing solution and press again, ensuring no leakage. Mount and secure the perfusion chamber onto the platform.Then, attach the perfusion and suction tubes for perfusion over the cells in the groove. Change the perfusion rate to approximately two milliliters per minute and turn on Ringer's solution perfusion. For measurements, open the imaging software.Set the microscope magnification to 10X using the left side button of the microscope. After choosing Live View, use the joystick to move the platform and focus on the cells in the groove. Select the appropriate wavelength for mCherry.Once the cells are focused, move the platform for the selection of appropriate cell patches. Select the Draw ROIs dropdown menu. Choose Draw Circular ROIs and draw ROIs on cell clusters with the mCherry-expressing cells.Create new ROIs beyond the first by holding down the Shift button and then by pressing and dragging the existing ROIs. Select Draw Square Background ROI from the dropdown menu and adjust the location and size of the background ROI where cells are not present. After ensuring the absence of cells in the background ROI, go to the ND Acquisition tab.Select the Wavelength subtab and mark its checkbox. Ensure that the checkbox for GFP wavelength is also marked. Click on the Time subtab and define the measurement interval as every five seconds and duration as 30 minutes.On the microscope panel, press the On to enable the Perfect Focus System, or PFS. Under ND Acquisition, ensure PFS on is ticked. Adjust the focus and click Run now.Start baseline period measurement for 90 seconds using Ringer's solution perfusion. After 90 seconds, switch from the Ringer's solution perfusion to the Ringer's zinc solution perfusion, and click the red flag on the bottom right of the main interface panel once the fluorescence rise starts to saturate. Change back to perfusion with Ringer's solution until the experiment time expires.To export the data with baseline subtraction, press the Background Correction button and view the changes in the ND Acquisition window. Click the Export button to save the data in the desired location. An increase in fluorescence resulted from increased intracellular zinc concentration, while a decrease indicated the activity of ZnT-1 transporting zinc across the cell membrane.The wild type ZnT-1 had a smoother fluorescence curve than the mutant, relating to the variability in the cellular responses to zinc load. A box plot comparing the activities of wild-type and delta USCTD showed similar average transport rates, indicating a lack of difference between the wild type and the mutant. However, the difference in the spread may indicate a functional difference.