אנו אסירי תודה למרכז וודסוורת' של מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק על תמיכתו בפרויקט זה.

הפרוטוקול הבא אושר לשימוש אתי בדגימות אנושיות על ידי מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק מרכז וודסוורת' לפיתוח מבחנים, מספר אישור פרוטוקול #03-019.
1. בטיחות
<ol><li>לבשו ציוד מגן אישי (PPE), לפחות מגן עיניים (משקפיים או מגן פנים), מסכה כירורגית וכפפות ללא לטקס.</li>
	<li>יש לוודא כי אנשי הצוות מחוסנים לכלבת וכי הודגם טיטר של ≥0.5 IU/mL במהלך 6 החודשים האחרונים.</li>
</ol>2. הכנת שקופית אנטיגן
הערה: בצע את כל המניפולציות של וירוסים, CSF וסרום בארון בטיחות ביולוגית (BSC) תוך שימוש באמצעי זהירות אוניברסליים.
<ol><li>הכינו 20 מ"ל של תאי נוירובלסטומה של עכבר או BHK-21 לריכוז של 3.0 x 105 תאים/מ"ל במדיה החיונית המינימלית של Eagle בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (EGM) ושמרו על קור עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו את נגיף CVS-11 על ידי דילול ב-EGM לדילול עובד של 1.0 x 106.5 50% תרבית רקמה במינון זיהומי (TCID50) למיליליטר ושמרו על קור עד שהוא מוכן לשימוש. הערה: TCID50 נקבע על ידי שיטת ריד ומואנץ' שפורסמה בעבר5.</li>
	<li>נקו תא מגלשות לחות ומגלשות מיקרוסקופ מצופות היטב מפוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) עם 70% אתנול ואפשרו להן להתייבש באוויר ב-BSC.</li>
	<li>הוסף מים מזוקקים (dH2O) לרצועות נייר סופג בתא השקופיות כדי להבטיח שהלחות תישאר קבועה לאורך כל ההליך.</li>
	<li>באמצעות עיפרון, תייג כל שקופית לשימוש עם מספר הפריט, התאריך, סוג התא וכל מידע מזהה אחר הדרוש לאחסון, והנח בתא השקופיות. הערה: רוב הסמנים, העטים או התוויות לא יעמדו בשלב קיבוע האצטון העתידי (שלב 2.9).</li>
	<li>החל 50 μL של דילול וירוס על כל באר על שקופיות המיקרוסקופ עם פיפטה חוזרת. לאחר מכן, להחיל 50 μL של דילול תאים על כל באר, נזהר לא לזהם את קצה פיפטה עם הנגיף כבר על הבאר.</li>
	<li>סגור את תא מגלשת הלחות והנח אותו באינקובטור הלח ב 34-36 מעלות צלזיוס. להעריך את זיהום התא לאחר 24 שעות. הערה: בצע את שלבים 2.8-2.12 בשקופית אחת בלבד.</li>
	<li>הסירו את המגלשה מתא הלחות ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט. שטפו את המגלשה בצנצנת קופלין מלאה במי מלח חוצצים בפוספט (PBS) למשך 2 דקות, ולאחר מכן הניחו למגלשה להתייבש באוויר.</li>
	<li>מניחים את המגלשה בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשה באצטון קר למשך שעה לפחות במקפיא של -20°C המאושר לחומרים דליקים. יש לבצע את כל הליכי יציקת האצטון וייבוש האוויר במכסה אדים.</li>
	<li>הניחו לאצטון להבהב והחליקו לייבוש. יש למרוח נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) מצומד שהוכן על פי הוראות היצרן על בארות המגלשה ולדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 34-36 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו את המגלשה בצנצנות קופלין של PBS פעמיים למשך 2 דקות כל אחת. יבשו את המגלשה באוויר.</li>
	<li>הרכיבו מכסה עם 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ו-20% גליצרול, וקראו את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 200x כדי להעריך את הזיהום. אם התאים אינם נגועים בכ-50%, חזרו על שלבים 2.7-2.12 למחרת עד להגעה להדבקה הרצויה. הערה: הדבקה בתאים משוערת בהתבסס על הערכה חזותית של היחס בין תאים שליליים לתאים חיוביים לכלבת בשקופית היטב. תאים שליליים מופיעים בצבע אדום, בעוד תאים חיוביים מראים צביעה פלואורסצנטית ירוקה.</li>
	<li>הסר את שאר המגלשות מהאינקובטור ומתא הלחות. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מכל באר, ואז הניחו את המגלשות בצנצנת קופלין עם PBS למשך 1-2 דקות. ייבשו את המגלשות באוויר למשך כ-30 דקות. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לשימוש.</li>
</ol>3. הכנת מדגם
<ol><li>הכינו דילול מדגם של סרום המטופל או CSF לבדיקה. הכינו את הצמידות הדרושה לריכוז עבודה תקין מדולל ב-PBS עם 0.05% כחול אוונס. הערה: שמור את המצומד בחושך כדי לשמור על שלמות הפלואורופור לפני היישום</li>
</ol>4. נוהל IFA
<ol><li>הסר את המספר הדרוש של שקופיות אנטיגן מוכנות הדרושות לכל בדיקה ואפשר לשקופיות להפשיר ולהתייבש לחלוטין.</li>
	<li>מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשות באצטון קר למשך בין שעתיים ללילה במקפיא בטמפרטורה של -20°C המאושר לשימוש בחומרים דליקים. הסר את המגלשות מהאצטון ואפשר להן להתייבש באוויר.</li>
	<li>הניחו את המגלשות בקופסת לחות בתוך ה-BSC עם רצועות סופגות ספוגות dH2O לשמירה על לחות. יש למרוח 50 μL מכל דילול דגימה, דגימת בקרה או PBS על הבאר שנקבעה מראש. הערה: כל שקופית חייבת להכיל מספר מתאים של בארות דגימת מטופלים, בקרה חיובית, בקרה שלילית ובקרת תאי PBS היטב.</li>
	<li>מקם את תא מגלשת הלחות הסגור באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 . דגרו על המגלשות במשך 30 דקות, ואז הוציאו את תא מגלשות הלחות מהאינקובטור והכניסו אותו ל-BSC.</li>
	<li>השתמש בקצה שואף כדי לשאוף בזהירות את supernatant מכל באר, להבטיח לא להפריע monolayer התא. השתמש פיפטה טפטפת סטרילית כדי להחיל טיפה אחת של PBS על כל באר.</li>
	<li>חזרו על השאיפה הזהירה, ואז הניחו כל מגלשה בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS ושטפו פעמיים במשך 15 דקות בסך הכל.</li>
	<li>החזירו את המגלשות לקופסת תא הלחות ומרחו 50 מיקרוליטר של נוגדנים אנטי-אנושיים מתאימים מצומדים לכל באר. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6.</li>
	<li>אפשרו לשקופיות להתייבש באוויר, הרכיבו משטח כיסוי עם אמצעי הרכבה וקראו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>5. ניתוח שקופיות
<ol><li>דגימות כיתה המבוססות על דפוס הצביעה ועוצמת הפלואורסצנטיות בהשוואה לדגימות ביקורת חיוביות עם נוגדנים נגד כלבת שאומתו כגבוהים.</li>
	<li>דרגו את הדגימות בסולם של שלילי, 1+, 2+, 3+ ו-4+, כאשר תוצאה שלילית אינה מראה צביעה פלואורסצנטית ו-4+ מייצגת פלואורסצנטיות בצבע ירוק בהיר עם דפוס צביעה דומה לדגימות ביקורת חיוביות1. הערה: צבע התפוח הירוק חל רק על נוגדנים המסומנים בתווית FITC; הצבע משתנה בהתאם לבחירת הפלואורופור.</li>
	<li>הקצה לדגימות ערך נקודת קצה המיוצג על-ידי גורם הדילול שבו הדגימה מציגה ציון 1-2+. בדוק את הדגימות בגורם דילול גבוה יותר אם לא הגיעו לנקודת הסיום בבדיקה הראשונית.</li>
</ol>

גילוי מהיר ומוקדם של נוגדני כלבת להערכת התגובה החיסונית בחולה

<ol>
	<li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1.">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , 232-245 (2018).</li><li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+rabies+serology:+defining+context+of+interpretation.">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516 (2021).</li><li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera.">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li><li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis.">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies.">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li><li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).</li><li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+(IgA)+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+(MIF)+method:+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit.">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li><li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies:+current+state+and+perspectives.">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li><li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+rabies:+a+literature+review.">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li><li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies-specific+antibodies:+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease.">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בדיקת IFA מנצלת קומפלקס נוגדנים אנטיגן, המאפשר אתר תיוג כדי להמחיש נוגדנים ספציפיים לכלבת. תאי נוירובלסטומה או BHK נזרעים על שקופיות מיקרוסקופ מרובות בארות מצופות PTFE ומחוסנים בזן מעבדה של נגיף הכלבת CVS-11. ברגע שהחד-שכבה מתמזגת והתאים מגיעים להדבקה הרצויה של כ-50%, השקופיות מאוחסנות עד שהן מוכנ?...

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) משמשת לאיתור איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. זהו אחד מארסנל של בדיקות זמינות למעקב אחר חולה כלבת לפני המוות. זה שימושי במיוחד עבור גילוי מוקדם של נוגדנים כדי להעריך את התגובה החיסונית של המטופל לזיהום כלבת. כאשר נעשה בה שימוש בשילוב עם בדיקות אחרות, היסטוריית מקרים וסטטוס החיסון של המטופל, בדיקת IFA יכולה לסייע בקביעת חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון1. מכיוון שבדיקת IFA מודדת IgM ו/או IgG, ערכי הנוגדן הספציפי יכולים להצביע על מסגרת זמן משוערת מחשיפה לאנטיגן1. בדיקה זו עשויה להיות שימושית ביישומים המפורטים או ביישומים אחרים שעדיין לא נחקרו.
ישנן מספר בדיקות סרולוגיות לכלבת זמינות. בדיקת עיכוב מיקוד פלואורסצנטי מהיר (RFFIT), בדיקת נטרול נגיף נוגדנים פלואורסצנטי (FAVN), או שינויים של אלה הן השיטות העיקריות למדידת נוגדנים מנטרלי נגיף הכלבת (RVNAs)1. עם זאת, בדיקות אלה אינן מבדילות נוגדנים IgM ו- IgG. כאשר הבחנה בין איזוטיפ נוגדנים חשובה בניטור התגובה החיסונית של הכלבת, נעשה שימוש בבדיקות כלבת IFA ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כלבת (ELISA), אך הן אינן מודדות RVNAs. למרות בדיקות IFA ו- ELISA ניתן להשתמש כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים כלבת בדגימה, ישנם כמה הבדלים באופן שבו הם מבוצעים. בדיקת IFA משתמשת בנגיף חי בתרבית תאים כמצע האנטיגן שלו, בעוד שבדיקת ELISA טיפוסית לגילוי כלבת משתמשת באחד או יותר מהחלבונים הנגיפיים. בסביבת מעבדה שבה ניתן לגדל את נגיף הכלבת, ניתן לבצע את בדיקת IFA בקלות רבה יותר במקום לרכוש או לטפח חלבונים נגיפיים בודדים עבור ELISA. יש לקחת בחשבון את מטרת הבדיקה ואת המידע המתקבל מתוצאות כל בדיקה סרולוגית של כלבת בעת ההחלטה באיזו בחירה2.
IgM הוא הראשון להגיב, גדל עד החלפת בכיתה נצפתה בסביבות היום 28, אז IgG הופך נוגדןבמחזור 3 השולט. לפיכך, IgM צפוי רק לפרק זמן מוגבל לאחר חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון. בדיקת הסרום והנוזל השדרתי (CSF) יכולה להצביע אם החשיפה הייתה באמצעות חיסון, שבו נוגדנים ייראו רק בסרה, או מזיהום ויראלי, שעשוי להראות נוגדנים ב- CSF1.
הוכח כי נוגדנים לכלבת נמשכים מספר שנים לאחר טיפול מונע לפני חשיפה (PrEP)4. בדיקת IFA יכולה להיות כלי שימושי להדגים זאת בנקודות זמן שונות לאחר החיסון או החשיפה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x55mm glass cover slips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgG Labeled Conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgM Labeled Conjugate</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>5230-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipette tip</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BION IFA Diluent</td>
			<td>MBL BION</td>
			<td>DIL-9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with FITC filter</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gullsorb IgM inactivation reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-158</td>
			<td>IgG Inactivation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7513</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media Eagle &#8211; w/Earle&#8217;s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuroblastoma Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well Teflon coating glass slides</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.6&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3032</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5100, 5500 or 6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride crystals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dropper</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma pre-set crystals pH 9.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9693</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rabies igg and igm antibodies using the rabies indirect fluorescent antibody test

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) פותחה כדי לאתר איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. בדיקה זו מספקת תוצאות מהירות וניתן להשתמש בה כדי לזהות נוגדנים לכלבת במספר תרחישים שונים. בדיקת IFA לכלבת שימושית במיוחד לגילוי מהיר ומוקדם של נוגדנים להערכת התגובה החיסונית בחולה שחלה בכלבת. למרות ששיטות אחרות לאבחון כלבת לפני המוות מקבלות עדיפות, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להדגים את החשיפה האחרונה לנגיף הכלבת באמצעות זיהוי נוגדנים. בדיקת IFA אינה מספקת נוגדנים מנטרלי וירוסים (VNA), אך ניתן להעריך את התגובה המונעת לפני חשיפה (PrEP) באמצעות נוכחות נוגדנים חיובית או שלילית. בדיקה זו יכולה לשמש במצבים שונים ויכולה לספק תוצאות למספר מטרות שונות. במחקר זה, השתמשנו במספר דגימות סרום מזווג מאנשים שקיבלו PrEP והדגמנו את נוכחות נוגדני הכלבת שלהם לאורך זמן באמצעות בדיקת IFA.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test is used to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. It is one of an arsenal of tests available for monitoring an antemortem rabies patient. It is especially useful for the early detection of antibodies to evaluate a patient's immune response to rabies infection. When used in conjunction with other tests, case history, and the patient's vaccination status, the IFA test can assist in determining exposure to rabies virus or a vaccine1. As the IFA test measures IgM and/or IgG, the values of the specific antibody can indicate an approximate time frame from exposure to the antigen1. This test may be useful in the listed applications or others not yet explored.
There are several rabies serological assays available. The rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT), fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test, or modifications of these are the primary methods for measuring rabies virus neutralizing antibodies (RVNAs)1. However, these tests do not differentiate IgM and IgG antibodies. When differentiating antibody isotype is important in monitoring the rabies immune response, the rabies IFA and the rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are used, but they do not measure RVNAs. Although the IFA and ELISA tests can be used to determine the presence of rabies-specific antibodies in a sample, there are some differences in how they are executed. The IFA test utilizes a cell-cultured live virus as its antigen substrate, whereas a typical ELISA for rabies detection uses one or more of the viral proteins. In a laboratory setting where the rabies virus can be cultured, the IFA test may be more easily performed instead of purchasing or cultivating individual viral proteins for the ELISA. The purpose of testing and the information garnered from the results of any rabies serological assay should be considered when determining which to choose2.
IgM is the first to respond, increasing until class switching is observed at around day 28, at which point IgG becomes the predominant circulating antibody3. Hence, IgM would only be expected for a limited amount of time following exposure to rabies virus or vaccination. Testing both serum and cerebrospinal fluid (CSF) can indicate if the exposure was through vaccination, in which antibodies would be seen only in sera, or from a viral infection, which would potentially show antibodies in CSF1.
It has been established that rabies antibodies persist for several years following pre-exposure prophylaxis (PrEP)4. The IFA test can be a useful tool to demonstrate this at different time points following vaccination or exposure.

מחבר זרקור: זיהוי איזוטיפים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי באמצעות בדיקת IFA 

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

The IFA test assesses antibody response during rabies infection or evaluates the immune response from vaccines. It can be used to establish antibody presence in a sample and distinguish which antibody isotypes are present. Neutralizing antibody assays are the gold standard for rabies antibody detection to assess antibody titer in a person who has received pre or post-exposure prophylaxis.Although an IFA test may yield different results than a neutralizing antibody assay, it can still provide valuable information when used as an alternative. Typically, assays that measure rabies neutralizing antibodies evaluate immune response. However, these tests take multiple days, requiring virus and live cell culture.The IFA test allows advanced preparation of antigen slides for testing with results in a few hours compared to days. Using the IFA tests in human rabies cases may lead to more answers about how an individual's immune system responds to rabies infection. There is great variation amongst cases, and this test can provide results in a real-time manner during the disease.

כל דגימות הסרום נאספו מהמטופלים בערך באותן מסגרות זמן לאחר PrEP. הדגימות נבדקו מחמישה חולים שונים בנקודות הזמן הבאות: שבועיים לאחר החיסון הסופי נגד כלבת, 6 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת ו-18 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת. כל דגימת סרום דוללה בסדרות ודורגה הן עבור נוכחות IgM והן עבור נוכחות IgG, כמ...

Watch this Scientific Journal Video about Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test at JoVE.com

מטרת כתב היד היא לבחון את השימוש בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת לאיתור נוגדנים ספציפיים לכלבת מסוג IgG ו-IgM.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

בדיקת IFA מעריכה את תגובת הנוגדנים במהלך הידבקות בכלבת או מעריכה את התגובה החיסונית מחיסונים. ניתן להשתמש בו כדי לבסס נוכחות נוגדנים בדגימה ולהבחין אילו איזוטיפים של נוגדנים קיימים. בדיקות נוגדנים מנטרלים הן תקן הזהב לזיהוי נוגדנים לכלבת כדי להעריך נוגדנים אצל אדם שקיבל טיפול מונע לפני או אחרי החשיפה.למרות שבדיקת IFA עשויה להניב תוצאות שונות מאשר בדיקת נוגדנים מנטרלים, היא עדיין יכולה לספק מידע בעל ערך כאשר משתמשים בה כחלופה. בדרך כלל, בדיקות המודדות נוגדנים מנטרלי כלבת מעריכות את התגובה החיסונית. עם זאת, בדיקות אלה אורכות מספר ימים, ודורשות תרבית וירוסים ותאים חיים.בדיקת IFA מאפשרת הכנה מתקדמת של שקופיות אנטיגן לבדיקה עם תוצאות תוך מספר שעות לעומת ימים. שימוש בבדיקות IFA במקרים של כלבת אנושית עשוי להוביל לתשובות נוספות על האופן שבו המערכת החיסונית של הפרט מגיבה לזיהום כלבת. קיימת שונות רבה בין המקרים, ובדיקה זו יכולה לספק תוצאות בזמן אמת במהלך המחלה.

detection-rabies-igg-igm-antibodies-using-rabies-indirect-fluorescent

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

1.3K Views.  New York State Department of Health. בדיקת IFA מעריכה את תגובת הנוגדנים במהלך הידבקות בכלבת או מעריכה את התגובה החיסונית מחיסונים. ניתן להשתמש בו כדי לבסס נוכחות נוגדנים בדגימה ולהבחין אילו איזוטיפים של נוגדנים קיימים. בדיקות נוגדנים מנטרלים הן תקן הזהב לזיהוי נוגדנים לכלבת כדי להעריך נוגדנים אצל אדם שקיבל טי...

Video: מחבר זרקור: זיהוי איזוטיפים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי באמצעות בדיקת IFA 

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. This test provides rapid results and can be used to detect rabies antibodies in several different scenarios. The rabies IFA test is especially useful for the quick and early detection of antibodies to evaluate the immune response in a patient who has developed rabies. Although other methods for antemortem rabies diagnosis take precedence, this test may be utilized to demonstrate recent rabies virus exposure through antibody detection. The IFA test does not provide a virus-neutralizing antibody (VNA) titer, but the pre-exposure prophylaxis (PrEP) response can be evaluated through positive or negative antibody presence. This test can be utilized in various situations and can provide results for a number of different targets. In this study, we used several paired serum samples from individuals who received PrEP and demonstrated their rabies antibody presence over time using the IFA test.

The aim of this manuscript is to examine the use of the rabies indirect fluorescent antibody test for the detection of rabies-specific IgG and IgM antibodies.