כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים

כמות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים. מקסיקו היא מדינה עם פוטנציאל בעלי חיים ניכר. המדינות עם ייצור בעלי החיים הגבוה ביותר מכילות הן אזורים טרופיים לחים והן אזורים יבשים הנמצאים בסיכון להתפרצויות כלבת בשל נוכחותו של עטלף הערפד, Desmodus rotundus, המשדר העיקרי של כלבת.

גילוי הגן nucleoprotein N של נגיף הכלבת משמש בעיקר לאבחון כלבת על ידי בדיקות מולקולריות. באמצעות גישות מבוססות PCR, ניתן לזהות כמויות מינימליות של סוכן זיהומיות במדגם קליני באמצעות הגברה סלקטיבית וחוזרת על עצמו של רצף נוקלאוטידים של DNA. qRT-PCR מבוסס על זיהוי וכימות של מולקולה שבה עליות אות פלואורסצנטיות הן ביחס ישיר לכמות של מוצר PCR בתגובה אחת.

ככל שמספר העותקים של מטרת חומצת הגרעין גדל, כך גם הפלואורסצנטיות. בהתבסס על זה, מטרת המחקר הייתה להשתמש qRT-PCR כמותי כדי לקבוע את מספר החלקיקים הנגיפיים במבנים אנטומיים שונים של מוחות שור, לאחר המוות, עקב זיהום כלבת. סך הכל RNA הוצא ישירות ממוחות שור באמצעות שיטת מיצוי אורגנית על פי הפרוטוקול הבא.

השתמש 100 מיליגרם של רקמת המוח מכל מבנה אנטומי כדי לחלץ RNA הכולל באמצעות מגיב זמין מסחרית המכיל guanidinium isothiocyanate. באופן ידני הומוגניזציה סך של 100 מיליגרם של רקמה מכל מבנה במיליליטר אחד של מגיב guanidinium isothiocyanate על ידי מערבולת באמצעות homogenizer Dounce עם עלה קטן בתוך microtube במשך 15 שניות במהירות המרבית. דגירה את הדגימות על קרח במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של כלורופורם.

מערבבים את הדגימות במרץ במשך 15 שניות. דגירה על קרח במשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12, 000 x g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את השלב המים לצינור נקי ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של אלכוהול איזופרופיל.

דגירה הדגימות במשך 15 דקות ב 21 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה הדגימות ב 12, 000 x g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף את העל-טבעי מימי על-ידי צנרת.

הרנ"א המבודד יהיה נוכח ככדור בצינור. לאחר מכן, לשטוף את גלולת RNA עם מיליליטר אחד של 75% אתנול על ידי pipetting וצנטריפוגה ב 7, 500 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. תוריד את הסופרנאטנט והאוויר ייבש את גלולת הרנ"א בטמפרטורת החדר, 21 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, לדלל את גלולה ב 50 מיקרוליטרים של מים ללא גרעין. לקבוע את ריכוז RNA ואיכות ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. שעתוק במבחנה יוצר mRNA של גן יעד.

השתמש בזוג פריימרים המגביר את הגן המלא RABV N, וכזה המשמש כפקד חיובי עבור בדיקת qRT-PCR. פריימרים אלה נועדו להגביר את הגן המלא RABV N, ולהוסיף מקדם שמכיר את פולימראז T7. כדי להגביר את הגן N כולו RABV, השתמש פריימרים טרנס ו RAB קדימה והפוך, וערכת PCR נאמנות גבוהה.

עבור כל תגובה, להכין תערובת PCR הורים על ידי הוספת מאגר תגובה נקי צינור PCR עם 10 micromolar של כל פריימר ו 0.5 יחידות של פולימראז נאמנות גבוהה. כדי להשתמש במוצר PCR כתבנית לסינתזת במבחנה ולהסיר רכיבים של התגובה האנזימטית, לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת רכז מבוססת עמודה, בהתאם להוראות היצרן. ואז לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר.

לסינתזת RNA, השתמשו בערכת שעתוק במבחנה עם תערובת התגובה הבאה:חמישה מיקרוליטרים T7 שעתוק 5X חיץ, 1.9 מיקרוליטרים של כל נוקלאוטיד טריפוספט, 10 מיקרוגרם של דנ"א RABV N מטוהר, ו 2.5 מיקרוליטרים של תערובת האנזימים. לאחר מכן, דגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של יחידה אחת לכל מיקרוגרם Rnase-חינם DNase לתערובת התגובה דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום DNA.

לטהר את RNA מעתיק במבחנה ולאחר מכן לרכז אותו באמצעות פנול:כלורופורם:אלכוהול isoamyl ביחס של 25:24:1. התחדש גלולת RNA מטוהרת לתוך 70 מיקרוליטרים של מאגר TE, ולאחר מכן לאחסן אותו ב 80 מעלות צלזיוס עד השימוש. חזור על פרוטוקול PCR עד לקבלת כחמישה מיקרוגרם של מוצר PCR.

לאחר טיהור וריכוז, mRNA גנים N מעתיק במבחנה יהיה נוכח בריכוז של 4.711 מיקרוגרם לכל מיקרוליטר. אשר כי mRNA מועתק במבחנה מתאים לגן N לאחר שלב חמש של פרוטוקול זה, ולהשתמש בזה כפקד חיובי עבור תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך בזמן אמת, qRT-PCR. לתגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך בזמן אמת, השתמש בתעתיק mRNA במבחנה ב קידוד הגן N המלא כפקד חיובי.

יחד עם ערכת qRT-PCR מסחרית חד-שלבית, באמצעות בדיקות הכלאה בהתאם להוראות היצרן. השתמש בבדיקה בפריימרים המתוארים על ידי Coronado ועמית לעבודה 2010 כדי לזהות אזור שמור של RABV באמצעות תנאי האופניים התרמיים הבאים. בצע דילול סדרתי של mRNA תעתיק במבחנה על ידי צינור סדרתי מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר של mRNA לתוך צינורות עד שישה דילול decoupled מתקבלים.

הכינו צינורות בנפח של 100 מיקרוליטר משולש לשימוש ביצירת העקומה הסטנדרטית. בצע qRT-PCR כמתואר לעיל. בצע qRT-PCR במחזור תרמי עם רוטור על-ידי עיבוד דגימות המוח השונות בו-זמנית עם התגובות הפועלות ליצירת עקומה סטנדרטית ושימוש בפקדים חיוביים, פקדים שליליים וגנטנטים המבודדים מתרבות התאים.

כדי להעריך את מגבלת הזיהוי, יעילות הבדיקה ורגישות הבדיקה, השתמש בעקומה סטנדרטית המשולשת באותם תנאים. לגילוי של גן RABV N, להשתמש RNA מדגימות שדה, פקדים חיוביים, פקדים שליליים, ו supernatants תרבות התא לבצע qRT-PCR באמצעות ערכת PCR שתואר בעבר. כדי לקבוע את מספר העותקים של הגנום RABV נוכח דגימות המוח שור, לקבל נתוני CT מן העקומה הסטנדרטית ודגימות ביולוגיות, ומן אלה interpolated מן המשוואה עקומת כיול איור זה מראה רקמות המוח שור המציגים כתמים חיוביים על פי immunofluorescence ישיר.

התוצאות מראות 100%100%83.3%66% ו 50% חיוביות עבור RABV בקליפת המוח, התלמוס, medulla, pons, וקרן בהתאמה. תוצאות אלו מאשרות את התוצאות הקודמות, ולפחות שלושה מהמבנים שניתחו מכל מוח היו חיוביים עבור RABV. מצד שני, המשוואה של העקומה הסטנדרטית מראה את הקשר בין כמות התוכן הגנטי RABV במדגם לבין גודל הקטע המוגבר של PCR.

כמות התוכן הגנטי RABV בננוגרם הוסק על ידי אינטרפולציה של ערכי CT בעקומת הכיול באמצעות המשוואה המוצגת באיור זה. באמצעות משוואה זו, מגבלת הגילוי של פעם אחת 10 למיקרוגרם החמישי לכל מיקרוליטר של RNA ויראלי נמצאה תואמת 36 עותקים של הגנום RABV. תוצאות אלו מראות כי הבדיקה רגישה וניתן להשתמש בה כדי לזהות את הנגיף בדגימות המכילות מספר נמוך של עותקים של הגן RABV N.

היעילות של ההסתעפות חושבה באמצעות השיפוע של העקומה הסטנדרטית, אשר היה 3.28. הדגימות המשמשות qRT-PCR הראו הגברה של הגן RABV N. כדי לקבוע את מספר העותקים הנגיפיים הקיימים, ערכי ה- CT עבור כל דגימה התערבבו באמצעות משוואת עקומת הכיול.

התוצאות שהתקבלו ננוגרם הוחלף הנוסחה המתוארת כאן. טבלה זו מציגה את התוצאות ההשוואתיות בין qRT-PCR ו- DFA. התוצאות של מבחני qRT-PCR היו עולות בקנה אחד עם אלה שהושגו באמצעות DFA.

על פי התוצאות שהתקבלו במבחן qRT-PCR במקרים C ו- D, התלמוס הוא המבנה בעל המספר הגבוה ביותר של עותקים של הגן RABV N. זה מרמז כי זיהום מוקדם של נוירונים היפותלמיים ותלמיים חשוב בהתפתחות המחלה, בהתחשב בכך נוירונים אלה לשלוט על הפונקציות הצמחיות של בעל חיים. מספרי ההעתקה של הגן RABV N שזוהו בכל מבנה של כל מדגם הם: הרגישות והספציפיות של בדיקת qRT-PCR שנינו 100%כמו כל הדגימות היו חיוביות.

תוצאה זו עולה בקנה אחד עם האבחנות הראשוניות של הדגימות. qRT-PCR היא טכניקה רגישה מאוד. חלק מהשלבים הם קריטיים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

אחד מאלה הוא הטיפול הנכון של דגימות עבור מיצוי RNA. שלב זה הוא חיוני כמו RNA הוא מושפל בקלות ואת התוצאות ולכן יכול להיות מושפע. שקול לשמור על המדגם בתנאים קרים, כארבע מעלות צלזיוס במהלך התהליך.

בנוסף, שקול כי מספר סבבים של יישום PCR מתבצעים כאמור בתעתיק במבחנה. בדיקת qRT-PCR שנערך במחקר זה יכול לזהות כמה 36.3 עותקים של הגן N RABV לכל מיליגרם של רקמה. מבני המוח המתאימים ביותר עבור qRT-PCR כללו את קליפת המוח ואת התלמוס.

זה מבוסס על תצפיות כי ריכוזים גבוהים יותר של הגן RABV N זוהו במבנים אלה, וכי הם נמצאו גם חיוביים באמצעות בדיקת התייחסות RABV. הבדיקה הצליחה לזהות ריכוזים נמוכים מאוד, 0.00023 פעמים 10 עד העותקים התשיעיים של הנגיף בדגימות שונות. בנוסף לכימות החלקיקים הנגיפיים במדגם, נראה כי הבדיקה מספקת כלי אבחון ומחקר חלופי טוב לגילוי RABV המוצג כאן.