פרוטוקול זה יכול לשמש לאבחון נתיחה שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים מהתצוגה הראשונית של הדיקציה בתחום לקונפורמציה המולקולרית ברמה ריכוזית של פעילות. בדיקות אבחון אימונוכרומטוגרפיות מהירות הן חלופה שימושית לתכונות כפריות וכפריות באפריקה ובאסיה שבהן חומרי עזר לאבחון כלבת אינם זמינים. הדגמת ההליך יהיה סיימון בונאס טכנאי מהמעבדה שלי.
הפגנת החלק הראשון של ההליך תהיה איברהימה דיקו, טכנאית מהווריד המרכזי של הלייבורטואר בבמקו, מאלי. כדי לגשת למגנום foramen, השתמש בסכין כדי להסיר את ראש החיה לפני החוליות הצוואריות הראשונות. ולהשתמש בכלי מתאים כדי לאסוף דגימת גזע המוח.
כגון פיפטה חד פעמית, קשית שתייה, מהדק או טפטף כפי שמוצג כאן. גזע המוח נראה אז בבירור כפי שהוכח כאן עם קצה פיפטה זו. השתמש בכלי המתאים כדי לאסוף חלק של גזע המוח הזה כגון קשית שתייה.
הכנס אותו בזהירות ולהפוך בעדינות כדי לאסוף את רקמת המוח. אל תשכח לחבר את הקש עם האצבע לפני הסרתו, על מנת לאסוף את הביופסיה. השימוש במלקחיים אפשרי גם כן.
על מנת לאסוף חתיכות גדולות יותר של גזע המוח ברמה של מגנום foramen. לחלופין, ניתן להשתמש ישירות בטפטף המסופק בערכה כדי לאסוף את גזע המוח. בדומה קש השתייה, להכניס את הטפטף בזהירות תוך כדי לחיצה ולהפוך בעדינות כדי לאסוף את רקמת המוח.
ואז שאף את רקמת המוח והצב אותה במיכל כמו פקק של צינור. לאבחון מדויק זה קריטי כדי לאסוף את גזע המוח המכיל את medulla ablongata, במהלך איסוף המדגם. בזהירות לרסק את החומר במוח ישירות בצינור המכיל את החיץ עם ספוגית או טפטף במשך כ 30 שניות עד השעיה הומוגנית מתקבל.
באמצעות הטפטפת, להפקיד ארבע טיפות כ 100 microliters של ההשעיה בפולס מדגם על מכשיר הבדיקה. במקרה של עיכוב עקב השעיית צמיגות גבוהה או כדי להאיץ את תחילת הנדידה, בעדינות לגרד את החלק התחתון של אתר ההפקדה של המכשיר עם הטפטפת. המתן להעברה לדוגמה מלאה, שעה עד חמש דקות לפני קריאת התקן הבדיקה.
מדגם נחשב חיובי עבור כלבת כאשר שני קווים גלויים. שלילי, אם רק קו הבקרה קיים. ולא חוקי אם רק שורת הבדיקה או ללא קווים גלויים.
כדי לחלץ את ה- RNA מדגם התקן, פתח בזהירות את ההתקן והסר את נייר הסינון. לאסוף את אזור הפיקדון של המדגם ולמקום את המדגם לתוך מיליליטר אחד של LS טרייגנט. לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה ידנית עדינה רגילה, לחלץ את RNA מן הצינורות על טבעי על פי פרוטוקולי מיצוי RNA סטנדרטיים. הוספת שני מיקרוליטרים של גליקוגן כדי להקל על משקעים RNA על פי המלצות היצרנים.
כוונן את הנפח הסופי של ה-RNA ל-50 מיקרוליטרים עם מים חופשיים בגרעין. והכן את פתרון תגובת המיקס הראשי לשלושת בדיקות ה- PCR הכמותיות השונות של התמלול ההפוך בהתאם לטבלה. שימוש פריימרים ובדיקות כפי שצוין בטבלה.
בחמישה מיקרוליטרים של דגימות רנ"א מדוללות. ו-15 מיקרוליטרים של תערובת אב לכל אחד משלושת הראיות השונות בכפילות ב-96 לוחות התגובה המתאימים. הוסיפו את הפקדים החיוביים והשליליים המתאימים לכל מקשה על כל לוח בשכפול.
לאחר מכן הפעל את בדיקות שונות בעקבות תנאי רכיבה תרמית כפי שצוין בטבלה. ניתן לנתח את התוצאות כמפורט בטבלה. האוסף של ביופסיה במוח הוא פשוט ככל האפשר כדי להבטיח את האוסף של דגימות באיכות גבוהה.
בהשוואה לטכניקת הייחוס הרגישות והספציפיות של בדיקת האבחון האימונוכרומטוגרפית המהירה הייתה גבוהה בכל המעבדות באמצעות פרוטוקולים אלה. בהתבסס על המספר המצטבר של דגימות שנבדקו, הרגישות הכללית והספנטיות היו מעל 95%% בדיקת האבחון האימונוכרומטוגרפית המהירה מתאימה לגילוי ליסהוירוס בביופסיות מוחיות מבעלי חיים נגועים. כמו רמת אנטיגנים lisavirus חשוב לאבחון כלבת, עם זאת, המגבלה של גילוי נשאר גבוה בעת בדיקת השעיות וירוס titrated.
בתוצאות ייצוגיות אלה, שהושגו לאחר זיהוי RNA על ידי כפול משולב panlisavirus הפוך תמלול PCR כמותי מיקוד של פולימראז ויראלי של lisavirus, פאנל של 51 בדיקות אבחון אימונוכרומטוגרפיות מהירות חיוביות בוצעו. בנוסף, genotyping יכול להתבצע עבור ארבע עשרה של הדגימות באמצעות מיקוד PCR מקונן hemi של הגן נוקליאופרוטאין חלקי. אבחון וחילוץ עבור רצועת הבדיקה עבור genotyping מבוסס על לאחר RT PCR, או על ידי ניתוח מחרוזות ארוך נוסף.
בדיקת האבחון האימונוכרומטוגרפית המהירה יכולה לספק אבחנה מהירה ומדויקת של כלבת. וזה חיוני לשמירה על תפקוד הגל במערכות מעקב ובקרה מבוססות גלים רציפות. ומזעור בני האדם.
