עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק 119/16) ומענק IMoh (3-15656) ל-IKG. ר.ש. נתמך על ידי מלגת קרייטמן.

קובץ ה- .ast, עם התבנית עבור Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) כדוגמה, מסופק בקובץ קידוד משלים 1.
1. הכנת מדיה
<ol><li>הכינו ציר Lactobacilli MRS בהתאם להוראות היצרן (55 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) וצלחות אגר Lactobacilli MRS עם אגר 1.5% (w/v) אגר (ראו טבלת חומרים). לאחר עיקור autoclave, המדיום מוכן לשימוש ישירות או ניתן לאחסן ב 4 °C.</li>
	<li>הכינו 50% (15 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) ציר סויה טריפטי (TSB) (ראו טבלת חומרים), TSB בתוספת 1% (w/v) D-(+)-גלוקוז ו-1% (w/v) D-(+)-raffinose, ואז אוטוקלאבה כדי לעקר את המדיום. עדיף לאחסן אותו ב 4 °C כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>עבור מדיום חוצץ עם גלוקוז, להכין TSB בתוספת 1% (w/v) D-(+)-גלוקוז, 5 mM של אשלגן פוספט monobasic יחד עם אשלגן dibasic, ו 100 mM MOPS (3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית, ראה טבלה של חומרים) pH 7. ואז autoclave כדי לעקר את המדיום.</li>
</ol>2. הכנת דגימות
הערה: שלב זה כולל הערכה של צבירה תאית בתגובה לסוכר מותסס או לא מותסס מהתזונה שלנו. ייצוג סכמטי של תהליך הכנת הדגימה מתואר באיור 1.
<ol><li>פזרו את זן Lactobacillaceae מציר גליצרול קפוא (50% גליצרול) על צלחת מרק Lactobacilli MRS (1.5% אגר). הערה: בניסוי לדוגמה שהוצג כאן, נעשה שימוש בזנים פרוביוטיים Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) ו-Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). כדי להרחיב מתודולוגיה זו לחברים פרוביוטיים נוספים של phylum firmicutes, Bacillus coagulans (ATCC 10545) נבחר.</li>
	<li>גדל את התאים בן לילה ב 37 ° C בתנאים סטטיים.</li>
	<li>לחסן 5 מ"ל של מרק Lactobacilli MRS עם מושבה אחת ולגדל אותו ב 37 ° C בתנאים סטטיים במשך הלילה.</li>
	<li>לדלל את תרבית התאים מן השלב הקודם (1:100) ב 3 מ"ל של 50% מרק סויה טריפטי (TSB), TSB בתוספת 1% (w / v) D-(+)-גלוקוז, או TSB בתוספת 1% (w / v) D-(+)-raffinose.</li>
	<li>יש לדגור למשך הלילה ב-37°C בתנאים סטטיים.</li>
	<li>הכינו את הדגימה על ידי ערבוב התאים באופן אחיד בתווך, וערברו בעדינות את צינור תרבית התאים משלב 2.5. הופכים בעדינות את המבחנה עד לערבוב מלא. מעבירים 200-300 μL לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הערה: חיוני לא לסניק את הדגימה כדי למנוע שבירת האגרגטים. במהלך איסוף הנתונים משלבים 3.4 עד 3.10, ייתכנו מקרים שבהם הדגימות מרוכזות מדי. אם נצפה כי הדגימה פועלת לאט מאוד או לא פועלת כלל, ניתן לדלל את הדגימה עם המדיום הטרי המתאים.</li>
</ol>3. רכישת נתונים
<ol><li>הגדר את ציטומטר זרימת ההדמיה בהתאם להוראות שסופקו על-ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הגדר את הלייזר של 785 ננומטר ל- 5 mW למדידת שדה כהה (שווה ערך לפיזור צד בציטומטריית זרימה קונבנציונלית, מקוצר כ- SSC). השתמש בעדשת 60x עם מפתח צמצם מספרי (N.A) של 0.9, בחר רגישות גבוהה והגדר את המהירות לנמוכה.</li>
	<li>לפני איסוף נתונים כלשהם, ודא את יציבות זרימת חרוזי הכיול בערוץ SSC. לחץ על כפתור ההפעלה בתיבה "fluidics" ובחן את איכות תמונות החרוזים. תמונות החרוזים צריכות להיראות חדות וחדות.</li>
	<li>לחץ על כפתור הטעינה והנח צינור עם דגימה (משלב 2.6) לתוך המחזיק.</li>
	<li>צור תרשים פיזור חדש בתיבה "סביבת עבודה". לחצו על New scatterplot ובחרו באזור בערוץ הבהיר המתאים לעוצמת ערוץ SSC. אל תכלול את חרוזי הכיול הפועלים במכשיר יחד עם הדגימה. הערה: ניתן להחריג חרוזים על ידי טעינת דגימה עם מאגר בלבד וזיהוי החרוזים באזור לעומת . עלילת SSC. לאחר מכן צייר שער סביב אוכלוסיית החרוזים באמצעות הלחצן צור אזור מצולע .</li>
	<li>בתיבה "הגדרות רכישה", הזן את שם המדגם, ציין את המיקום עבור אחסון הנתונים, בחר את האוכלוסייה (כל התאים ללא חרוזים) להקלטה והגדר את מספר האירועים שייאספו. בדרך כלל, 10,000-20,000 אירועים מספיקים.</li>
	<li>לחץ על כפתור הקלט הממוקם בתיבה "רכישה", ותהליך הרכישה יסתיים אוטומטית ברגע שתגיע למספר האירועים שצוין.</li>
	<li>לחץ על הלחצן Return כדי לפרוק את הצינור, והסר את הצינור מהמחזיק כאשר תתבקש לעשות זאת בחלון קטן.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.9 עבור כל דגימה.</li>
	<li>שמור את התבנית כדי לשמור על אחידות רכישת הנתונים עבור החזרות הבאות.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>למדוד את אחוז (%) הצבירה האוטומטית מהאוכלוסייה.<ol><li>נתח את הנתונים המתקבלים בציטומטר זרימת ההדמיה באמצעות תוכנת IDEAS (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>צור קובץ ניתוח נתונים ( .daf) מהקובץ הגולמי ( .rif) על-ידי טעינת הקובץ ( .rif) בתוכנת הניתוח. לחץ על קובץ כפתור ופתח את הקובץ הנדרש ( .rif). בחלון הפתוח, לחץ על ניתוח רכישת שימוש ולאחר מכן לחץ על אישור.</li>
		<li>צור היסטוגרמה של RMS הדרגתי (מדידת ניגודיות תמונה ומיקוד) בערוץ שדה בהיר כדי לזהות אירועים ממוקדים. באזור הניתוח, לחץ על הלחצן היסטוגרמה חדשה . בחלון "היסטוגרמה חדשה", בחר את האוכלוסייה מהרכישה כדי לנתח, ובתכונה "ציר x", בחר RMS הדרגתי של ערוץ brightfield.<ol><li>מקמו שער בלחיצה על הלחצן 'צור אזור קו ' באזור הניתוח כדי לא לכלול אירועים לא ממוקדים (איור 2A). הערה: בדרך כלל, אזור הקו "ממוקד" צריך לכלול 80%-90% מהאירועים עם ציון RMS בעל השיפוע הגבוה ביותר, אך יש לקבוע ערכי סף ספציפיים עבור תאים "ממוקדים" עבור כל מערך ניסוי.</li>
		</ol></li>
		<li>צור תרשים פיזור של השטח (מיקרומטר2) לעומת יחס הרוחב-גובה (רוחב חלקי אורך האליפסה המתאימה ביותר) של ערוץ שדה בהיר. לחץ על הלחצן New Scatterplot באזור הניתוח. בחלון "New Scatterplot", בחר את האוכלוסייה הממוקדת משלב 4.1.3.<ol><li>בחרו 'אזור בערוץ brightfield' לתכונה 'ציר x' ו'יחס גובה-רוחב ' של ערוץ brightfield לתכונה 'ציר y'. תרשים פיזור זה מאפשר לאוכלוסייה הממוקדת להבחין בין סינגלים ואירועי צבירה קטנים לבין אגרגטים ושרשראות מיקרוביאליות גדולות יותר.</li>
		</ol></li>
		<li>בתרשים פיזור זה, ציירו שער באמצעות הלחצן 'צור אזור מלבן ' (או 'צור אזור מצולע') בהתבסס על ערך השטח עבור אוכלוסיית אירועי הצבירה, ושער נוסף עבור אוכלוסיית הסינגלטים והצברים הקטנים (איור 2B). הערה: ברקעים מסוימים, הפרדת אגרגטים קטנים מסינגלים עשויה להיות מאתגרת, כך שניתן לשלב אותם באותו שער. הדבר נכון גם לגבי אגרגטים ושרשראות גדולים יותר (איור 3).</li>
		<li>סקור והערך באופן ידני תמונות של אירועים בתוך כל שער כדי לאמת את אמינות אסטרטגיית הגאט. במידת הצורך, התאם את ערך האזור לשער. בצע זאת על ידי בחירת האוכלוסייה הנסקרת מהתפריט הנפתח "אוכלוסיות". הערה: לגאטינג אין ערך שטח ספציפי, מכיוון שהוא יכול להשתנות בהתאם למאפייני החיידקים המנותחים.</li>
		<li>שמור את ניתוח הנתונים כתבנית. לחץ על הכרטיסיה קובץ , בחר שמור בשם Template.ast ופתח את הקובץ הבא לדוגמה ( .rif) תחת אותה תבנית כדי ליצור את קובץ ניתוח הנתונים ( .daf) (תמיכה בקובץ .ast כדוגמה עבור LGG).</li>
		<li>צור טבלת סטטיסטיקה כדי למנות אירועי מפתח לניתוח נוסף. לחץ על הכרטיסייה דוחות ולאחר מכן לחץ על הגדר דוח סטטיסטיקה.</li>
		<li>בחלון החדש, לחץ על הוסף עמודות. הוסף את ספירת הסינגלים/צברים ואת הנתונים הסטטיסטיים של % מגודרים. תחת "סטטיסטיקה", בחר %gated/count, ותחת האוכלוסייה שנבחרה, בחר singlets/aggregates. לחץ על הוסף סטטיסטיקה כדי להוסיף את הסטטיסטיקה לרשימה ולשמור אותה כתבנית.</li>
		<li>לחץ על צור דוח סטטיסטי ובחר את תבנית הסטטיסטיקה ואת הקבצים ( .daf) לניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד את התפלגות הגודל של האגרגטים.<ol><li>כדי לנתח את הגודל הממוצע של אירועי הצבירה, שרטט היסטוגרמה של השטח (מיקרומטר2) של אוכלוסיית אירועי הצבירה משלב 4.1.5 (איור 2C).</li>
		<li>שמור את ניתוח הנתונים כתבנית. לחץ על הכרטיסייה קובץ , בחר שמור כתבנית, ופתח את הקובץ הבא לדוגמה ( .rif) תחת אותה תבנית עבור קובץ ניתוח הנתונים ( .daf).</li>
		<li>חזור על שלבים 4.1.7-4.19. עבור גודל המצרפים, בחר ממוצע תחת סטטיסטיקה ובחר אגרגטים תחת האוכלוסייה שנבחרה. תחת תכונות, בחר אזור של ערוץ brightfield. לחץ על הוסף סטטיסטיקה כדי להוסיף את הסטטיסטיקה לרשימה ולשמור אותה כתבנית.</li>
		<li>חזור על שלב 4.1.9 כדי ליצור דוח סטטיסטי.</li>
	</ol></li>
</ol>

ניתוח כמותי של אוטואגרגציה מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימה של הדמיה

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה לכימות עוצמות פלואורסצנטיות בתאים איקריוטים, אך היא עשויה שלא לספק מדידות מדויקות עבור תאי חיידקים בשל גודלם הגדול יותר או אגרגטים קטנים. גורמים אלה יכולים להשפיע באופן משמעותי על הכימות המדויק של אוטואגרגציה ועל הרמה הבסיסית של היווצרות אגרגטים בתנאים ש?...

צבירה עצמית של חיידקים נחשבת לשלב ראשוני בהיווצרות ביופילם. בתהליך זה (המכונה לעתים גם autoagglutination או flocculation), חיידקים מאותו סוג יוצרים גושים רב-תאיים שבסופו של דבר מתיישבים בתחתית צינורות התרבית או נצמדים לרקמת המטרה או לפני השטח שלהם1.
אוטואגרגציה היא תופעה נפוצה והוכחה עד כה בפתוגנים גראם-שליליים כגון הפתוגן האופורטוניסטי Acinetobacter baumannii2, הפתוגן הדנטלי Aggregobacter actinomycetemcomitans3, והפתוגן המתהווה Burkholderia pseudomallei4. צבירה עצמית תוארה גם במספר זנים פרוביוטיים גראם-חיוביים 5,6,7,8. בלקטובצילוס (L.) אצידופילוס, אוטואגרגציה תווכה חלקית על ידי חלבונים בשכבת S ובקורלציה עם היצמדות לקסילן7. באופן דומה, מצאנו מתאם בין צבירה עצמית תלוית גלוקוז לבין השראת תכונות הדבק (כפי שנמדדו על ידי הידבקות למוצין) של הזנים הפרוביוטיים Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei ו-Lactiplantibacillus plantarum5. הצבירה העצמית המוגברת שיקפה ככל הנראה שינויים בביטוי של דבקים תאיים בתגובה לגלוקוז ולקטוליטים שלו9. בעוד שהמנגנונים המולקולריים של צבירה עצמית עדיין לא נקבעו, הוכח כי תהליך זה משנה את הפנוטיפ של החיידקים המצטברים ומעניק להם עמידות משופרת לגורמי עקה סביבתיים1, כמו גם רגישות מוגברת למולקולות חישת מניין10.
מספר גישות שימשו למדידת אוטואגרגציה; גישה ניסיונית אחת היא לתת לתרבויות לעמוד באופן סטטי בצינורות תרבות צרים למשך זמן נתון. תרביות בקרה נשארות עכורות, בעוד שתרביות אוטואגרגציה ישקעו בתחתית הצינור. גישה כמותית יותר מודדת צבירה עצמית על ידי שיקוע או שיקוע11.
ציטומטריית זרימה משמשת יותר ויותר בשנים האחרונות לחקר אוטואגרגציה חיידקית. שיטה זו מתאימה לניתוח חלקיקים בגודל של בין 0.5 ל -1000 מיקרומטר בקירוב. החיידק הבודד או האגרגטים שנוצרו מרחפים בנוזל, מוזנים לזרם, וניתן לזהותם בזה אחר זה11. הקלטת אור מפוזר קדימה מאפשרת למדוד את הגודל היחסי של התא או הצבירה. הוא מהיר ופשוט יחסית, אך אינו יכול לזהות מספר פרמטרים, כגון גודל צבירה או מספר התאים הממוצע בצברים. לכן, גישה זו יכולה להיות משלימה מיקרוסקופית, המאפשר פרמטרים נוספים להיבדק12. עם זאת, מיקרוסקופיה מסורתית גוזלת זמן ולכן מגבילה את מספר הדגימות שנבדקו ואת הכוח הסטטיסטי של הניתוח. באופן כללי, ציטומטריית זרימה של הדמיה מספקת מספר תכונות בהשוואה לציטומטריית זרימה מסורתית, כגון ניתוח סימולטני של מורפולוגיה ופנוטיפ של התא, ביצוע ניתוח מבוסס תמונה, איתור אירועים נדירים ואימות נתוני ציטומטריית זרימה13. יתרונות אלה משפרים את היכולות של ציטומטריית זרימה ומאפשרים בחינה מפורטת יותר של אוכלוסיות תאים.
מחקר זה מספק פרוטוקול רב ערך עבור ציטומטריית זרימת הדמיה לניטור אוטואגרגציה בחיידקי חומצה לקטית (LAB). מוטות גראם-חיוביים אלה הם אנארובים פקולטטיביים ושייכים לקבוצת LAB. מתסיסי גלוקוז יעילים אלה מייצרים חומצה לקטית כתוצר הסופי העיקרי של חילוף החומרים של פחמימות14. חיידקים אלה הם חברי ליבה מועילים של המיקרוביום והם נמצאים באופן טבעי במערכת העיכול (GIT) של בני אדם ובעלי חיים, כמו גם במערכת השתן של נקבות15. לכן, האפיון המדויק של תכונות הצבירה העצמית שלהם הוא בעל עניין ביוטכנולוגי וקליני גבוה.
הממצאים הקודמים שלנו הצביעו על כך שהרמה הבסיסית של צבירה עצמית שונה בין זנים פרוביוטיים שונים. הטרוגניות זו מושפעת מהפחמימות השונות המשמשות כמקור פחמן5. כדי להתגבר על תכונה בסיסית זו של חיידקים פרוביוטיים, ההשפעות של פחמימות מהתזונה נוטרו על צבירה אוטומטית ברמת התא היחיד באמצעות IFC. גישה מבוססת IFC זו משלבת את העוצמה והמהירות של ציטומטרים מסורתיים של זרימה עם הרזולוציה של המיקרוסקופ. לכן, הוא מאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית16,17. גישה זו יכולה להיות מורחבת לחיידקים פרוביוטיים ופתוגניים אחרים, בשילוב עם כתבים פלואורסצנטיים כדי לנטר ביטוי גנים, וזנים מסומנים פלואורסצנטית כדי לפקח על נוכחות ושפע של מיני חיידקים ספציפיים באגרגטים הטרוגניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

חיידקים מועילים ופרוביוטיים ממלאים תפקידים חיוניים בפונדקאים שלהם, ומספקים יתרונות בריאותיים שונים, כולל חסינות למחלות זיהומיות. משפחת Lactobacillaceae מורכבת מחיידקים גראם-חיוביים עם תכונות פרוביוטיות מוכחות. מחקר זה משתמש בזני Lactobacillaceae כמודל להדגמת היעילות של ניתוח תפוקה גבוהה של תא בודד בחקר צבירה תאית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של מינים מועילים אלה לפחמימות פשוטות מהתזונה.
המחקר מראה כיצד ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) יכולה להתגבר על ההבדלים הבסיסיים בהרכבה של חיידקים פרוביוטיים בנוכחות והיעדר פחמימות. IFC משלב את העוצמה והמהירות של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה, ומאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית על פני ספרייה של זנים ותנאים מועילים של חיידקים. פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי הצבירה העצמית של מיני Lactobacillaceae ושופך אור על התגובה שלהם לפחמימות תזונתיות, מה שתורם להבנת המנגנונים מאחורי ההשפעות המועילות של חיידקים פרוביוטיים אלה.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

מחבר זרקור: קידום המחקר באואגרגציה מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה למדוד בקלות את ההבדלים באוטאגרגציה בתגובה לסוכרים תזונתיים בחיידקי LAB. על ידי הפרדת פרטים מאגרגטים, השיטה מאפשרת לחשב את אחוז האוכלוסייה של אירועי הצבירה מתוך כל האירועים בתגובה לסוכרים מותססים או לא מותססים מהתזונה. בנוסף, ניתן היה למדוד אם יש הבדלים בגודל ?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

מחקר זה השתמש בזני לקטובצילוס כמודל כדי להדגים את היעילות של ניתוח ציטומטריה של זרימת הדמיה בחקר אוטואגרגציה מיקרוביאלית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של צבירה עצמית של מיני לקטובצילוס לפחמימות פשוטות מהתזונה. השיטות הנפוצות ביותר למדידת אוטואגרגציה הן פוטומטריה ספקטרלית, המודדת מתלים מיקרוביאליים, עכירות או צפיפות אופטית, וטכניקות מיקרוסקופיות מסורתיות, כגון שדה בהיר, ניגודיות פאזה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.כאשר מדברים על הדמיה בתפוקה גבוהה, אחד האתגרים הניסיוניים העיקריים הוא פילוח אירוע בודד. בפרוטוקול זה, זהו צבר יחיד. ציטומטריית זרימת הדמיה מתמודדת עם אתגר זה באלגנטיות ומעניקה לחוקרים כלי רב עוצמה לחקר אוטואגרגציה.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

503 Views.  Ben-Gurion University of the Negev. מחקר זה השתמש בזני לקטובצילוס כמודל כדי להדגים את היעילות של ניתוח ציטומטריה של זרימת הדמיה בחקר אוטואגרגציה מיקרוביאלית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של צבירה עצמית של מיני לקטובצילוס לפחמימות פשוטות מהתזונה. השיטות הנפוצות ביותר למדידת אוטואגרגציה הן פוטומטריה ספקטרלית...

Video: מחבר זרקור: קידום המחקר באואגרגציה מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

לקטובצילצאה הכנת דגימה לאנליזה ציטומטרית של זרימה

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.