이 연구는 광둥 기초 및 응용 기초 연구 재단(Jing-Da Qiao에 보조금 번호 2022A151111123)의 지원을 받았으며 GMU(Jing-Da Qiao)의 과학 연구를 강화할 계획입니다. 이 작업은 광저우 의과대학 학생 혁신 능력 향상 계획(자금 지원 번호 02-408-2304-02038XM)의 지원도 받았습니다.

1. Bang-sensitive 분석을 위한 프로토콜
<ol><li>Gal4/UAS 시스템(21)을 통해 tub-Gal4 드라이버 라인과 UAS-cac-RNAi 라인을 교차하여 실험용 파리를 설정합니다. tub-Gal4 라인의 처녀 파리와 UAS-cac-RNAi 라인의 수컷 파리를 수집합니다. 그런 다음 처녀 파리와 수컷 파리를 같은 유리병에 옮겨 새끼를 수확합니다. 참고: tub-Gal4 드라이버 라인을 사용하면 cac 유전자의 전역 knockdown을 달성할 수 있습니다. UAS-cac-RNAi 라인을 대조군으로 사용합니다.</li>
	<li>3-5일 동안 폐색한 후 100%CO2 (CO2 마취 장비)를 사용하여 파리를 부드럽게 마취하고 브러시로 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 파리와 UAS-cac-RNAi 파리를 모두 수집합니다. 이 파리는 테스트 1일 전에 깨끗하고 새 식품 바이알로 옮겨 잘 준비되었는지 확인합니다.</li>
	<li>CO2를 사용하여 파리를 부드럽게 마취합니다. 마취가 끝나면 4-6 마리의 파리를 각각의 신선한 바이알에 조심스럽게 넣습니다. 테스트를 진행하기 전에 파리가 약 1시간 동안 마취에서 회복되도록 합니다. 참고: 각 유전자형에 대해 최소 5건의 임상시험이 진행되었으며, 각 임상시험은 6개의 파리 바이알로 구성되었습니다.</li>
	<li>녹음 장비를 설정합니다. 화이트보드 앞 삼각대에 카메라(720-1080P, 최소 30-60FPS, AF 고정)를 배치합니다. 빈 바이알을 사용하여 카메라의 초점을 수동으로 조정하여 선명하고 정확한 영상을 보장합니다.</li>
	<li>소용돌이 믹서를 사용하여 기계적으로 유도된 발작과 같은 동작을 수행합니다. 4-6개의 파리가 들어 있는 각 바이알을 소용돌이 믹서에 놓고 가장 높은 설정(2800rpm)에서 정확히 10초 동안 실행합니다. 소용돌이가 끝나면 즉시 바이알을 화이트보드에 놓습니다.</li>
	<li>파리를 관찰하고 파리가 보이는 발작과 유사한 행동을 기록하십시오. 참고: 파리에서 관찰되는 발작과 유사한 행동은 발작(진동하는 날개로 나타남), 마비, 회복의 세 단계로 구성된다24. 발작 파리와 실험된 파리의 비율은 발작률로 정의되었습니다.<ol><li>파리가 똑바로 설 수 있는 능력을 회복할 때까지 와류 후 필요한 시간으로 회복 시간을 측정합니다25.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 생체 외 뇌의 칼슘 이미징을 위한 프로토콜
<ol><li> tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 및 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 라인 플라이를 각각 설정합니다. 생체외 뇌에서 칼슘 활성을 모니터링할 수 있도록 Gal4/UAS 이진 발현 시스템(21)을 사용하여 파리를 생성한다.</li>
	<li>제공된 레시피(표 1)26에 설명된 대로 해부 용액을 준비합니다.<ol><li>표 1에 설명된 대로 외부 솔루션을 준비합니다. NaOH로 pH 7.2로 조정하고 삼투압을 250-255mOsm/L로 조정합니다. 알림: 외부 용액은 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>해부 용액을 준비하기 위해 외부 용액 600μL에 파파인 현탁액 9단위와 L-라이신(2mg/mL)을 추가합니다. 용액을 소용돌이치고 용액이 맑아질 때까지 15분 동안 기다립니다. 알림: 해부 용액은 4시간 이내에 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>사용하기 전에 외부 용액에 산소화 식염수(95% 산소 및 5% 이산화탄소)를 5분 동안 관류하십시오. 피펫을 사용하여 약 10μL의 해부 용액을 페트리 접시로 옮깁니다. 이 솔루션은 뇌 해부 및 영상에 필요한 조건을 제공합니다.</li>
	<li>주사기 바늘과 현미경을 사용하여 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 및 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 라인의 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 뇌 해부에 대해 확립된 프로토콜을 따르십시오27.</li>
	<li>피펫을 사용하여 준비된 뇌를 5mL의 신선한 외부 용액이 들어 있는 기록 접시에 옮기고 회복을 위해 기록 접시에 C-sharp 홀더를 사용하여 뇌를 3-5분 동안 고정합니다. 알림: C-sharp 홀더는 7mm 간격의 평행 섬유가 교차하는 직경 0.5mm의 금속 반원으로 만들어졌습니다.</li>
	<li>공초점 이미징 설정 및 획득<ol><li>컨포칼 이미징의 경우 20x 대물렌즈와 xyt 스캐닝 모드로 각 뇌를 캡처합니다. 20x 광학 증폭을 기반으로 한 추가 4.5x 디지털 증폭으로 버섯 몸체 뉴런을 식별합니다. 참고: 각 생체 외 뇌는 1시간 이상 이미징할 수 있습니다.</li>
		<li>16μw 레이저 출력으로 488nm 레이저 여기(excitation)에서 전체 뇌-GCaMP6m 방출을 획득합니다. 스캔 매개변수를 400 픽셀 x 256 픽셀의 픽셀 크기로 설정합니다. 5.3Hz 획득 속도를 사용하고 3분 동안 녹음합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모든 뇌에서 5-8개의 ROI를 식별하고 형광을 분석합니다. 버섯 몸체 뉴런의 세포체를 관심 영역으로 수동으로 결정28.<ol><li>식별된 뉴런에 레이블을 지정하고 ImageJ로 형광 강도를 측정합니다. %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B)를 통해 GCaMP6m의 형광 데이터를 분석합니다. 기준선에서 2 - 2.5 표준 편차 증가하는 세포 내 형광을 작은 스파이크로 정의하고, 기준선보다 2.5 표준 편차 이상 증가하는 세포 내 형광을 큰 스파이크로 정의합니다. 스튜던트 t-검정으로 칼슘 급증 빈도를 분석합니다. 참고: F0은 ROI의 초기 5개 프레임의 평균 형광 강도에 의한 기준선으로, F1은 주어진 시점의 형광 강도로, B는 형광이 없는 배경으로 정의되었습니다. 뉴런의 시간적 생리적 활동도 노이즈 신호와 구별하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Calcium Imaging을 통한 Drosophila 의 간질형 이벤트 모니터링

<ol>
	<li>Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+in+adults.">Epilepsy in adults.</a> Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).</li><li>Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+genetics:+Clinical+impacts+and+biological+insights.">Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights.</a> Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy-associated+genes.">Epilepsy-associated genes.</a> Seizure. 44, 11-20 (2017).</li><li>Oliver, K. 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칼슘 이온은 화학적 및 전기적 섭동에 대한 다양한 생리학적 및 병태생리학적 반응에서 중추적인 역할을 하는 중요한 두 번째 메신저 역할을 합니다. 또한, 인간 CACNA1A 유전자에 의해 암호화되는 시냅스전 P/Q 채널의 위상 요소는 글루타메이트30,31,32를 포함한 다양한 신경 전달 물질의 배출을 매개하는 것으로 확인되었?...

간질은 자발적이고 이유 없는 발작과 비정상적인 신경 네트워크 활동의 재발을 특징으로 하는 복잡한 만성 신경 장애로, 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미치며 가장 흔한 신경 질환중 하나이며1 가족과 사회에 큰 부담을 줍니다. 뇌전증의 영향을 고려하여 발작의 원인을 규명하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 그 중 유전학은 많은 유형의 간질 또는 간질 증후군의 주요 원인으로 승인되었다2. 지난 수십 년 동안 게놈 기술의 발전으로 인해 이온 채널 및 비이온 채널 유전자를 포함하여 발작 발생에 중요한 역할을 하는 새로운 간질 관련 유전자의 발견이 급격히 증가했습니다 3,4. 그러나 유전자와 간질 표현형 사이의 근본적인 메커니즘과 기능 분석은 완전히 이해되지 않았습니다. 뇌전증 관련 유전자 및 기전을 규명하는 것은 환자를 효율적으로 관리할 수 있는 가능성을 제공한다 5,6.
세포질 칼슘 신호는 신경 활동과 시냅스 전달의 중추적인 요소입니다. 뇌 절편(brain slices)7, 생체 내(in vivo)8,9 및 생체내 e-x vivo(10)를 포함하는 칼슘 이미징(calcium imaging)은 1970년대 이래로 신경 세포 흥분성의 표지자로서 신경 활동(neuronal activity)11을 모니터링하기 위해 이용되어 왔다12,13. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)와 결합된 이미징 기술의 최근 발전은 높은 수준의 시공간 정밀도를 가진 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 14,15,16 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. 칼슘 농도와 과도현상의 변화는 활동 전위와 시냅스 전달에서 각각 관찰되었으며,14 이는 세포 내 칼슘 수준의 변화가 뉴런의 전기적 흥분성과 엄격한 상관 관계를 나타낸다는 것을 나타낸다17,18. 칼슘 영상은 또한 발달 발작 모델(developmental seizure model)9로 적용되었으며, 항경련 화합물(anticonvulsive compounds)을 스크리닝하기 위해 초파리(Drosophila)에서 수행되었다19.
Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석20,21,22로 간질과 같은 과학 연구에서 강력한 모델 유기체로 부상하고 있습니다. 또한, 초파리의 고급 유전 도구는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 GCaMP6의 발현에 기여했습니다. 예를 들어, Gal4 및 UAS 기반 바이너리 전사 시스템은 공간적, 시간적으로 제어되는 방식으로 GCaMP6의 특정 발현을 가능하게 합니다. 초파리는 아주 작은 유기체이기 때문에, 생체 내 칼슘 이미징은 외과적 개입을 수행하기 위해 능숙한 수술 기술을 필요로 하는데, 이 수술에서는 뇌의 등쪽의 작은 부분만이 작은 창을 통해 노출되었다14,23. 동시에 초파리의 온전한 뇌에서 생체 외 칼슘 이미징을 사용하여 전체 뇌의 관심 영역(ROI)을 모니터링할 수 있습니다.
이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 제시합니다. CACNA1A 잘 알려진 간질 유전자이며, cac는 CACNA1A에 대한 상동체인 Cav2 채널에 속합니다. 우리는 cac 넉다운 파리 tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi의 뇌를 해부하고 xyt 스캐닝 모드의 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 것으로 시작했습니다. 그런 다음 %ΔF/F 값 및 GCaMP6 형광의 칼슘 이벤트와 같은 자발적 발작 유사 이벤트를 정량화하는 지표를 계산하여 ROI의 칼슘 신호 변화를 분석했습니다. 또한 칼슘 이미징 결과를 검증하기 위해 cac-knockdown 파리에 대한 발작 행동 테스트를 유도하기 위해 vortex machine에 의한 기계적 자극을 수행했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 체외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색할 수 있도록 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brushes</td>
			<td>Panera</td>
			<td>AAhc022-2</td>
			<td>for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>SP8; Zeiss, Jena, Germany.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anesthesia machine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for Anesthetizing the flies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-sharp holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for mounting the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture vials</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>51-0500</td>
			<td>2.5 cm diameter, 9.5 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version: 2.14.0</td>
			<td>for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly morgue</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>cac-RNAi</td>
			<td>27244</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>GCaMP6m</td>
			<td>42750</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>tub-Gal4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution camera</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1480/02D</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4640010, 4640030, 4640050, 4640060</td>
			<td>for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150682- Glass Based Dish</td>
			<td>for holding the brain and calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-binocular microscope</td>
			<td>SHANG GUANG</td>
			<td>XTZ-D</td>
			<td>for handling flies and dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>pythonbio</td>
			<td>HCL0693</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td>WEIFENG</td>
			<td>45634732523</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z653438</td>
			<td>for performing the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whiteboard</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, foam pad or paper for background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for drosophila model of epilepsy

간질은 재발성 발작을 특징으로 하는 신경 장애로, 유전적 기원과 부분적으로 관련이 있으며 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미칩니다. 간질의 임상적 중요성에도 불구하고 중추 신경계의 신경 활동에 대한 기능적 분석은 여전히 개발되어야 합니다. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표의 안정적인 발현과 함께 이미징 기술의 최근 발전은 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석으로 인해 간질의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위한 도구로 등장했습니다. 이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 위한 새롭고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 뇌 전체는 잘 알려진 간질 유전자인 cac로 준비되며, 강타 민감성 발작 유사 행동 분석의 후속 조치로 신경 활동을 식별하기 위해 컨포칼 현미경으로 칼슘 이미징을 위해 녹다운 파리를 만듭니다. cac 넉다운 파리는 야생형 파리보다 더 큰 스파이크와 더 적은 작은 스파이크를 포함하여 발작과 유사한 행동과 비정상적인 칼슘 활동의 비율이 더 높았습니다. 칼슘 활동은 발작과 유사한 행동과 상관관계가 있었다. 이 방법론은 간질에 대한 병원성 유전자를 스크리닝하고 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색하는 데 효율적인 방법론 역할을 합니다.

Epilepsy, a complex chronic neurological disorder characterized by the recurrence of spontaneous and unprovoked seizures and aberrant neuronal network activity, has affected over 70 million individuals worldwide, making it one of the most common neurological diseases1 and leading to the heavy burdens of families and society. In consideration of the impact of epilepsy, many studies have been conducted to identify the etiology of seizures, of which genetics has been approved as a primary cause of many types of epilepsies or epileptic syndromes2. For the past decades, advances in genomic technologies have led to a rapid increase in the discovery of novel epilepsy-associated genes, which play a crucial role in seizure occurrence, including ion channels and non-ion channel genes3,4. However, the underlying mechanisms and functional analysis between the genes and epileptic phenotypes are incompletely understood. Identifying epilepsy-associated genes and mechanisms offers the possibility to the management of patients efficiently5,6.
Cytosolic calcium signals are pivotal elements in neuronal activity and synaptic transmission. Calcium imaging, including brain slices7, in vivo8,9, and ex vivo10, has been utilized to monitor neuronal activity11 as a marker for neuronal excitability since the 1970s12,13. Recent advancements in imaging technology, in combination with the genetically encoded calcium indicators (GECIs), such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels14,15,16, which has a high level of spatiotemporal precision. Changes in calcium concentration and transients were observed in action potentials and synaptic transmission, respectively14, indicating the alteration of intracellular calcium levels exhibits a strict correlation with the electrical excitability of neurons17,18. Calcium imaging has also been applied as a developmental seizure model9 and performed in Drosophila for screening anticonvulsive compounds19.
Drosophila melanogaster has been emerging as a powerful model organism in scientific research, such as epilepsy, for its sophisticated molecular genetics and behavioral assays20,21,22. Moreover, the advanced genetic tools in Drosophila have contributed to the expression of genetically encoded calcium indicator GCaMP6. For instance, the Gal4 and UAS-based binary transcriptional systems enable specific expression of the GCaMP6 in a spatially and temporally controlled manner. Since Drosophila is a tiny organism, in vivo calcium imaging requires proficient operation skills to perform a surgical intervention, in which only a small part of the dorsal of the brain was exposed through a small window14,23. At the same time, ex vivo calcium imaging in the intact brain of Drosophila can be used to monitor the regions of interest (ROIs) of the whole brain.
In this study, we present ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. CACNA1A is a well-known epilepsy gene, cac belongs to Cav2 channel, which is a homolog to CACNA1A. We began by dissecting the brains of cac knockdown flies tub-Gal4&#62;GCaMP6m/cac-RNAi and imaging them using a confocal microscope with xyt scanning mode. We then analyzed the changes in calcium signals of ROIs by calculating indicators that quantify spontaneous seizure-like events, such as %&#916;F/F value and calcium events of GCaMP6 fluorescence. Additionally, we performed mechanical stimulus by vortex machine to induce seizure behavior tests on cac-knockdown flies as well to validate the results of calcium imaging. Overall, this protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

저자 스포트라이트: 간질 연구의 최근 발전에 대한 기술 및 연구 결과에 대한 통찰력 

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Recently, many epilepsy candidate gene have been found in gene tests and then readily by animal experiments. We deliver a set of techniques to study the epilepsy-related neural activity, including whole cell recording, evoked EPSP recording and the new one that we will introduce here, ex vivo calcium imaging. Since the integrity of the brain and its neural networks cannot be fully replicated in cell culture or brain slices, the main advantage of the current experiment is to obtain intact brain tissue while protecting neural networks from damage.We have established an ex vivo calcium imaging technique along with the band-sensitive seizure-like behavior assay for efficiently screening the epilepsy-associated genes and exploring the underlying mechanisms of epilepsy at the cellular level. We implemented isolated, intact Drosophila brain tissues for calcium imaging, which can avoid their complex surgical techniques and preserve the integrity of neural networks. And the ex vivo approach can also yield the superior signal to noise ratio when compared with the in vivo imaging techniques.

이 프로토콜을 사용하여 cac 넉다운 파리가 WT 파리보다 발작 유사 행동의 비율이 훨씬 더 높다는 것을 발견했습니다(17.00 ± 2.99 [n = 6] 대 4.50 ± 2.03 [n = 6]; 피 = 0.0061; 스튜던트 t-검정, 그림 1A). 대부분의 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 파리는 1-5초 이내에 회복된 반면, UAS-cac-RNAi 파리는 2초 이내에 회복되었습니다. 1초 이내에 cac 넉다운 파리의 ?...

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여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

최근에는 유전자 검사와 동물 실험에서 많은 뇌전증 후보 유전자가 발견되고 있습니다. 우리는 전체 세포 기록, 유발 EPSP 기록 및 여기에서 소개할 새로운 기술인 생체 외 칼슘 이미징을 포함하여 간질 관련 신경 활동을 연구하기 위한 일련의 기술을 제공합니다. 뇌와 신경망의 무결성은 세포 배양이나 뇌 절편에서 완전히 복제될 수 없기 때문에 현재 실험의 주요 이점은 신경망을 손상으로부터 보호하면서 온전한 뇌 조직을 얻는 것입니다.우리는 간질 관련 유전자를 효율적으로 스크리닝하고 세포 수준에서 간질의 근본적인 메커니즘을 탐구하기 위해 밴드 민감성 발작 유사 행동 분석법과 함께 생체 외 칼슘 이미징 기술을 확립했습니다. 칼슘 이미징을 위해 분리된 온전한 초파리 뇌 조직을 구현하여 복잡한 수술 기법을 피하고 신경망의 무결성을 보존할 수 있습니다. 또한 생체 외 접근 방식은 생체 내 이미징 기술과 비교할 때 우수한 신호 대 잡음비를 산출할 수 있습니다.

ex-vivo-calcium-imaging-for-drosophila-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

940 조회수.  the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University. 최근에는 유전자 검사와 동물 실험에서 많은 뇌전증 후보 유전자가 발견되고 있습니다. 우리는 전체 세포 기록, 유발 EPSP 기록 및 여기에서 소개할 새로운 기술인 생체 외 칼슘 이미징을 포함하여 간질 관련 신경 활동을 연구하기 위한 일련의 기술을 제공합니다. 뇌와 신경망의 무결성은 세포 배양이나 뇌 절편에서 완전히 복제될 수 없기 때문에 현재 실험의 주요 이점은 신?...

비디오: 저자 스포트라이트: 간질 연구의 최근 발전에 대한 기술 및 연구 결과에 대한 통찰력 

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

연구

신경과학

Bang-Sensitive Assay for the Study of Seizure-Like Behavior in Drosophila

Bang-Sensitive Assay for the Study of Seizure-Like Behavior in Drosophila  

To begin, collect the virgin flies of the tub-Gal4 hybrid line and the male flies of the UAS-cac-RNAi line. Transfer the virgin and male flies into the same vial to harvest the offspring. After three to five days of occlusion, use a brush to collect the offspring and the tub-GL4 UAS-cac-RNA flies.A day before testing, transfer the flies to new clean vials with food. Next, carefully place four to six carbon dioxide anesthetized flies into individual fresh vials. Place a camera on a tripod in front of a whiteboard.Manually adjust the camera's focus with an empty vial. Now, vortex the vials with the flies at the highest setting for 10 seconds. Immediately place the vial on the whiteboard and observe the flies for any seizure-like behavior.Measure the recovery time as the time required for the flies to regain the ability to stand upright. The cac knockdown flies showed significantly higher rates of seizure-like behavior than the wild type flies. The recovery percentage of knockdown flies within one second was significantly lower than the wild type flies.

초파리의 발작 유사 행동 연구를 위한 Bang-Sensitive Assay

Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis  

To begin, perfuse the external solution with oxygenated saline for five minutes. With a pipette, transfer 10 microliters of the dissection solution to a Petri dish. Now, use syringe needles and a microscope to carefully dissect the brains of the anesthetized established wild type and knockout flies.With a pipette, transfer the prepared brain into a recording dish with five milliliters of external solution. Immobilize the brains with a C sharp holder. Next, capture the confocal image of each brain at 20x.Use the XYT scanning mode and identify the mushroom body neurons at an additional 4.5 times digital amplification. Set the laser excitation to 488 nanometers with 16 micro watt laser power to acquire the whole brain GCaMP6m emission. Then set the scanning parameters to 1400 speed with a pixel size of 256 by 256 pixels.Set the acquisition rate to 5.3 hertz and record for three minutes. Analyze the fluorescence of five to eight regions of interest. Manually determine the cell body of mushroom body neurons as the region of interest.Use image J to label the identified neurons and measure their fluorescence intensities. Analyze the fluorescence data of GCaMP6m as shown. Define the intracellular fluorescence increasing between two and 2.5 standard deviations as small spikes and those increasing more than 2.5 standard deviations as large spikes.Calcium signals were observed in the mushroom body of flies. The cac knockdown flies showed more large spikes than small spikes.