Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Investigação Básica e Básica Aplicada de Guangdong (bolsa n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) e pretende melhorar a investigação científica em GMU (Jing-Da Qiao). Este trabalho também foi apoiado pelo Plano de Capacitação de Inovação de Estudantes da Universidade de Medicina de Guangzhou (Financiamento No. 02-408-2304-02038XM).

1. Protocolo para ensaio bang-sensitive
<ol><li>Estabelecer as moscas experimentais cruzando a linha condutora tub-Gal4 com a linha UAS-cac-RNAi através do sistema Gal4/UAS21. Coletar as moscas virgens da linhagem tub-Gal4 e as moscas machos da linhagem UAS-cac-RNAi . Em seguida, transfira as moscas virgens e machos para o mesmo frasco para colher a prole. NOTA: A linha de driver tub-Gal4 permitirá alcançar o knockdown global do gene cac . Use a linha UAS-cac-RNAi como grupo controle.</li>
	<li>Após 3-5 dias de eclosão, anestesiar suavemente as moscas usando o CO2 a 100% (equipamento de anestesia CO2 ) e coletar as moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi e UAS-cac-RNAi com uma escova. Transfira essas moscas para frascos de alimentos novos e limpos 1 dia antes do teste para garantir que estejam bem preparadas.</li>
	<li>Anestesie suavemente as moscas usando o CO2. Uma vez anestesiado, coloque cuidadosamente 4-6 moscas em frascos frescos individuais. Permita que as moscas se recuperem da anestesia por cerca de 1 h antes de prosseguir com o teste. NOTA: Para cada genótipo, um mínimo de cinco ensaios foram testados, e cada ensaio consistiu de seis frascos de moscas.</li>
	<li>Configure o aparelho de controlo. Posicione uma câmera (720-1080P, 30-60 FPS pelo menos, AF travado) em um tripé na frente de um quadro branco. Ajuste o foco da câmera manualmente usando um frasco para injetáveis vazio para garantir imagens claras e precisas.</li>
	<li>Use um misturador de vórtices para executar o comportamento semelhante a uma convulsão induzida mecanicamente. Coloque cada frasco para injetáveis contendo 4-6 moscas no misturador de vórtices e execute-o na configuração mais alta (2800 rpm) durante exactamente 10 s. Após o vórtice, coloque imediatamente o frasco para injetáveis no quadro branco.</li>
	<li>Observe as moscas e registre qualquer comportamento semelhante a uma convulsão que elas exibem. NOTA: O comportamento semelhante a uma convulsão observado em moscas consiste em três estágios: convulsão (manifestando-se como asas vibratórias), paralisia e recuperação24. A proporção de moscas convulsivas para moscas testadas foi definida como taxa de crises.<ol><li>Meça o tempo de recuperação como o tempo necessário após o vórtice até que as moscas recuperem a capacidade de ficar em pé25.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocolo para cintilografia de cálcio em cérebro ex vivo
<ol><li>Estabeleça as moscas da linha tub-Gal4>UAS-GCaMP6m e tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , respectivamente. Gerar as moscas usando o sistema de expressão binária Gal4/UAS21 para permitir o monitoramento da atividade de cálcio no cérebro ex vivo .</li>
	<li>Preparar a solução de dissecção conforme descrito na receita fornecida (Tabela 1)26.<ol><li>Prepare a solução externa conforme descrito na Tabela 1. Ajustar para pH 7,2 com NaOH e ajustar a osmolaridade para 250-255 mOsm/L. NOTA: A solução externa pode ser armazenada a 4 °C durante 1 semana.</li>
		<li>Para preparar a solução de dissecção, adicionar 9 unidades de suspensão de papaína e L-lisina (2 mg/mL) a 600 μL da solução externa. Vórtice a solução e aguarde 15 minutos até que a solução esteja límpida. NOTA: Recomenda-se usar a solução de dissecção dentro de 4 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfundir a solução externa com soro fisiológico oxigenado (oxigênio a 95% e dióxido de carbono a 5%) por 5 minutos antes do uso. Use a pipeta para transferir cerca de 10 μL da solução de dissecção para uma placa de Petri. Esta solução fornecerá as condições necessárias para a dissecção cerebral e exames de imagem.</li>
	<li>Disseque cuidadosamente os cérebros das linhas tub-Gal4>UAS-GCaMP6m e tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi usando as agulhas da seringa e o microscópio. Seguir o protocolo estabelecido para dissecçãocerebral27.</li>
	<li>Use uma pipeta para transferir o cérebro preparado para uma placa de gravação contendo 5 mL de solução externa fresca e imobilize o cérebro usando um suporte C-sharp na placa de gravação por 3-5 min para recuperação. OBS: O suporte em C afiado foi confeccionado em semicírculo metálico com 7 mm de diâmetro atravessado por fibras paralelas a 0,5 mm de distância.</li>
	<li>Configuração e aquisição de imagens confocais<ol><li>Para imagens confocais, capture cada cérebro com uma objetiva de 20x e o Modo de Varredura xyt. Identifique os neurônios do corpo do cogumelo com uma amplificação digital adicional de 4,5x baseada em amplificação óptica de 20x. NOTA: Cada cérebro ex vivo pode ser fotografado por mais de 1 h.</li>
		<li>Adquira toda a emissão cérebro-GCaMP6m a 488 nm de excitação a laser com potência de laser de 16 μw. Defina os parâmetros de digitalização para uma velocidade de 400, com um tamanho de pixel de 256 pixels x 256 pixels. Use uma taxa de aquisição de 5,3 Hz e registre por uma duração de 3 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique 5-8 ROIs em cada cérebro e analise a fluorescência. Determinar manualmente o corpo celular dos neurônios do corpo do cogumelo como a região de interesse28.<ol><li>Rotule os neurônios identificados e meça suas intensidades de fluorescência pelo ImageJ. Analise os dados de fluorescência de GCaMP6m via %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). Definir a fluorescência intracelular, aumentando entre 2 e 2,5 desvios padrão acima da linha de base, como pequenas pontas, e a fluorescência intracelular, aumentando acima de 2,5 desvios padrão acima da linha de base, como grandes espículas. Analise a frequência de picos de cálcio pelo teste t de Student. NOTA: F0 foi definido como a linha de base pela intensidade média da fluorescência dos 5 quadros iniciais em ROIs, F1 como a intensidade de fluorescência do ponto de tempo dado e B como o fundo sem fluorescência. As atividades fisiológicas temporais dos neurônios também são úteis para distingui-los dos sinais de ruído.</li>
	</ol></li>
</ol>

Monitoramento de eventos epileptiformes em Drosophila por meio de imagens de cálcio

<ol>
	<li>Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+in+adults.">Epilepsy in adults.</a> Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).</li><li>Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+genetics:+Clinical+impacts+and+biological+insights.">Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights.</a> Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy-associated+genes.">Epilepsy-associated genes.</a> Seizure. 44, 11-20 (2017).</li><li>Oliver, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes4epilepsy:+An+epilepsy+gene+resource.">Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource.</a> Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).</li><li>Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+antiseizure+drugs+and+the+ketogenic+diet.">Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).</li><li>Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gated+sodium+channel+genes+in+epilepsy:+Mutations,+functional+studies,+and+treatment+dimensions.">Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions.</a> Front Neurol. 12, 600050 (2021).</li><li>Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pentetrazol+on+neuronal+activity+and+on+extracellular+calcium+concentration+in+rat+hippocampal+slices.">Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices.</a> Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).</li><li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neural+activity.">In vivo imaging of neural activity.</a> Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li><li>Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+seizure+activity+in+a+novel+developmental+seizure+model.">In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model.</a> Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).</li><li>Ishimoto, H., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+calcium+imaging+for+visualizing+brain+responses+to+endocrine+signaling+in+drosophila.">Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila.</a> J Vis Exp. 136, 57701 (2018).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+calcium-sensitive+photoproteins+aequorin+and+obelin.">Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).</li><li>Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoproteins+as+biological+calcium+indicators.">Photoproteins as biological calcium indicators.</a> Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+gcamp+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+dendritic+excitation+in+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo.</a> Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).</li><li>Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+in+the+living+brain:+Prospects+for+molecular+medicine.">Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine.</a> Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).</li><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+signals+in+vivo:+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology.">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).</li><li>Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+neuronal+activity+in+drosophila+can+identify+anticonvulsive+compounds.">Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds.</a> PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).</li><li>Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+and+epilepsy:+Studies+of+seizure+disorders+in+drosophila.">Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).</li><li>Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila.</a> Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li><li>Liu, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+strategies+based+on+behavioral+and+electrophysiological+methods+for+epilepsy-related+gene+screening+in+the+drosophila+model.">Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model.</a> Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+odor-evoked+distributed+neural+activity+in+the+drosophila+mushroom+body.">Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body.</a> Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unc13b+variants+associated+with+partial+epilepsy+with+favourable+outcome.">Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome.</a> Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).</li><li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+suppression+involving+behavioral+mutants+with+altered+nerve+excitability+in+drosophila+melanogaster.">Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster.</a> Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).</li><li>Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+whole-cell+recordings+in+adult+drosophila+brain.">Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain.</a> Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).</li><li>Gu, H., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+brain+of+adult+drosophila.">Whole cell recordings from brain of adult drosophila.</a> J Vis Exp. (6), 248 (2007).</li><li>Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-timing-dependent+plasticity+at+incoming+synapses+of+the+mushroom+body+facilitates+olfactory+learning+in+drosophila.">Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila.</a> Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).</li><li>Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+CACNA1A+deficiency+against+seizure+in+the+CACNA1A-CELSR2+digenic+knockdown+flies.">Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies.</a> Research Square. , (2023).</li><li>Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2.1+voltage+activated+calcium+channels+and+synaptic+transmission+in+familial+hemiplegic+migraine+pathogenesis.">Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis.</a> J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).</li><li>Le Roux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cacna1a-associated+epilepsy:+Electroclinical+findings+and+treatment+response+on+seizures+in+18+patients.">Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients.</a> Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).</li><li>Alehabib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+spectrum+of+p/q+type+calcium+channel+cav2.1+in+epileptic+patients.">Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).</li><li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cacna1a+mutations+associated+with+epilepsies+and+their+molecular+sub-regional+implications.">Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications.</a> Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).</li><li>Indelicato, E., Boesch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genotype+to+phenotype:+Expanding+the+clinical+spectrum+of+cacna1a+variants+in+the+era+of+next+generation+sequencing.">From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing.</a> Front Neurol. 12, 639994 (2021).</li><li>Saras, A., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+calcium+channel+gene+cacophony+suppress+seizures+in+drosophila.">Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila.</a> Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).</li><li>Cozzolino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+epileptiform+activity+in+zebrafish+by+statistical-based+integration+of+electrophysiology+and+2-photon+ca2++imaging.">Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging.</a> Cells. 9 (3), 769 (2020).</li><li>Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+seizure+induction+methods+in+drosophila.">Characterization of seizure induction methods in drosophila.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li><li>Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+joy+of+balancers.">The joy of balancers.</a> Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia<s...

A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns1 e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a um rápido aumento na descoberta de novos genes associados à epilepsia, que desempenham um papel crucial na ocorrência de crises, incluindo canais iônicos e genes de canais não iônicos 3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes e a análise funcional entre os genes e fenótipos epilépticos são incompletamente compreendidos. A identificação de genes e mecanismos associados à epilepsia oferece a possibilidade de um manejo eficiente dos pacientes 5,6.
Sinais citosólicos de cálcio são elementos fundamentais na atividade neuronal e transmissão sináptica. A imagem do cálcio, incluindo os cortes cerebrais7, in vivo8,9 ee x vivo10, tem sido utilizada para monitorar a atividade neuronal11 como marcador de excitabilidade neuronal desde a década de 197012,13. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com os indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais 14,15,16, que apresenta um alto nível de precisão espaço-temporal. Alterações na concentração de cálcio e transientes foram observados nos potenciais de ação e transmissão sináptica, respectivamente14, indicando que a alteração dos níveis intracelulares de cálcio apresenta estreita correlação com a excitabilidade elétrica dos neurônios17,18. A cintilografia com cálcio também tem sido aplicada como modelo de crise do desenvolvimento9 e realizada em Drosophila para triagem de compostos anticonvulsivantes19.
Drosophila melanogaster vem emergindo como um poderoso organismo modelo em pesquisas científicas, como a epilepsia, por sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais20,21,22. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas em Drosophila têm contribuído para a expressão do indicador de cálcio codificado geneticamente GCaMP6. Por exemplo, os sistemas transcricionais binários baseados em Gal4 e UAS permitem a expressão específica do GCaMP6 de forma controlada espacial e temporalmente. Como a Drosophila é um organismo minúsculo, a imagem do cálcio in vivo requer habilidades operacionais proficientes para realizar uma intervenção cirúrgica, na qual apenas uma pequena parte do dorso do cérebro foi exposta através de uma pequena janela14,23. Ao mesmo tempo, imagens de cálcio ex vivo no cérebro intacto de Drosophila podem ser usadas para monitorar as regiões de interesse (ROIs) de todo o cérebro.
Neste estudo, apresentamos imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. CACNA1A é um gene bem conhecido da epilepsia, o cac pertence ao canal Cav2, que é um homólogo ao CACNA1A. Começamos dissecando os cérebros de moscas knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e imageando-os usando um microscópio confocal com modo de varredura xyt. Em seguida, analisamos as mudanças nos sinais de cálcio das ROIs por meio do cálculo de indicadores que quantificam eventos espontâneos semelhantes a crises, como o valor de %ΔF/F e eventos de cálcio da fluorescência GCaMP6. Adicionalmente, realizamos estímulos mecânicos por máquina de vórtice para induzir testes de comportamento convulsivo em moscas cac-knockdown, bem como para validar os resultados da imagem de cálcio. Em geral, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos Drosophila através de imagens de cálcio ex vivo, permitindo a exploração dos mecanismos potenciais da epilepsia em nível celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brushes</td>
			<td>Panera</td>
			<td>AAhc022-2</td>
			<td>for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>SP8; Zeiss, Jena, Germany.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 anesthesia machine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for Anesthetizing the flies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-sharp holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for mounting the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture vials</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>51-0500</td>
			<td>2.5 cm diameter, 9.5 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version: 2.14.0</td>
			<td>for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly morgue</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, for handling flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>cac-RNAi</td>
			<td>27244</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>GCaMP6m</td>
			<td>42750</td>
			<td>from Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stocks</td>
			<td>tub-Gal4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution camera</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLW1480/02D</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4640010, 4640030, 4640050, 4640060</td>
			<td>for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150682- Glass Based Dish</td>
			<td>for holding the brain and calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-binocular microscope</td>
			<td>SHANG GUANG</td>
			<td>XTZ-D</td>
			<td>for handling flies and dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>pythonbio</td>
			<td>HCL0693</td>
			<td>for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td>WEIFENG</td>
			<td>45634732523</td>
			<td>for recording the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z653438</td>
			<td>for performing the seizure-like behavior assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whiteboard</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>handmade, foam pad or paper for background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for drosophila model of epilepsy

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.

Epilepsy, a complex chronic neurological disorder characterized by the recurrence of spontaneous and unprovoked seizures and aberrant neuronal network activity, has affected over 70 million individuals worldwide, making it one of the most common neurological diseases1 and leading to the heavy burdens of families and society. In consideration of the impact of epilepsy, many studies have been conducted to identify the etiology of seizures, of which genetics has been approved as a primary cause of many types of epilepsies or epileptic syndromes2. For the past decades, advances in genomic technologies have led to a rapid increase in the discovery of novel epilepsy-associated genes, which play a crucial role in seizure occurrence, including ion channels and non-ion channel genes3,4. However, the underlying mechanisms and functional analysis between the genes and epileptic phenotypes are incompletely understood. Identifying epilepsy-associated genes and mechanisms offers the possibility to the management of patients efficiently5,6.
Cytosolic calcium signals are pivotal elements in neuronal activity and synaptic transmission. Calcium imaging, including brain slices7, in vivo8,9, and ex vivo10, has been utilized to monitor neuronal activity11 as a marker for neuronal excitability since the 1970s12,13. Recent advancements in imaging technology, in combination with the genetically encoded calcium indicators (GECIs), such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels14,15,16, which has a high level of spatiotemporal precision. Changes in calcium concentration and transients were observed in action potentials and synaptic transmission, respectively14, indicating the alteration of intracellular calcium levels exhibits a strict correlation with the electrical excitability of neurons17,18. Calcium imaging has also been applied as a developmental seizure model9 and performed in Drosophila for screening anticonvulsive compounds19.
Drosophila melanogaster has been emerging as a powerful model organism in scientific research, such as epilepsy, for its sophisticated molecular genetics and behavioral assays20,21,22. Moreover, the advanced genetic tools in Drosophila have contributed to the expression of genetically encoded calcium indicator GCaMP6. For instance, the Gal4 and UAS-based binary transcriptional systems enable specific expression of the GCaMP6 in a spatially and temporally controlled manner. Since Drosophila is a tiny organism, in vivo calcium imaging requires proficient operation skills to perform a surgical intervention, in which only a small part of the dorsal of the brain was exposed through a small window14,23. At the same time, ex vivo calcium imaging in the intact brain of Drosophila can be used to monitor the regions of interest (ROIs) of the whole brain.
In this study, we present ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. CACNA1A is a well-known epilepsy gene, cac belongs to Cav2 channel, which is a homolog to CACNA1A. We began by dissecting the brains of cac knockdown flies tub-Gal4&#62;GCaMP6m/cac-RNAi and imaging them using a confocal microscope with xyt scanning mode. We then analyzed the changes in calcium signals of ROIs by calculating indicators that quantify spontaneous seizure-like events, such as %&#916;F/F value and calcium events of GCaMP6 fluorescence. Additionally, we performed mechanical stimulus by vortex machine to induce seizure behavior tests on cac-knockdown flies as well to validate the results of calcium imaging. Overall, this protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Autor em destaque: insights sobre as técnicas e descobertas de avanços recentes na pesquisa da epilepsia 

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Recently, many epilepsy candidate gene have been found in gene tests and then readily by animal experiments. We deliver a set of techniques to study the epilepsy-related neural activity, including whole cell recording, evoked EPSP recording and the new one that we will introduce here, ex vivo calcium imaging. Since the integrity of the brain and its neural networks cannot be fully replicated in cell culture or brain slices, the main advantage of the current experiment is to obtain intact brain tissue while protecting neural networks from damage.We have established an ex vivo calcium imaging technique along with the band-sensitive seizure-like behavior assay for efficiently screening the epilepsy-associated genes and exploring the underlying mechanisms of epilepsy at the cellular level. We implemented isolated, intact Drosophila brain tissues for calcium imaging, which can avoid their complex surgical techniques and preserve the integrity of neural networks. And the ex vivo approach can also yield the superior signal to noise ratio when compared with the in vivo imaging techniques.

Usando este protocolo, descobrimos que as moscas knockdown cac mostraram taxas significativamente mais altas de comportamento semelhante a convulsões do que as moscas WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Teste t de Student, Figura 1A). A maioria das moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 1-5 s, enquanto UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 2 s. A porcentagem de recuperação de moscas knockdown de <e...

Watch this Scientific Journal Video about Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research at JoVE.com

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Recentemente, muitos genes candidatos à epilepsia foram encontrados em testes genéticos e, em seguida, prontamente por experimentos animais. Entregamos um conjunto de técnicas para estudar a atividade neural relacionada à epilepsia, incluindo gravação de células inteiras, gravação evocada EPSP e a nova que apresentaremos aqui, a imagem ex vivo de cálcio. Uma vez que a integridade do cérebro e suas redes neurais não podem ser totalmente replicadas em cultura de células ou fatias cerebrais, a principal vantagem do experimento atual é obter tecido cerebral intacto, protegendo as redes neurais de danos.Estabelecemos uma técnica de imagem de cálcio ex vivo juntamente com o ensaio de comportamento semelhante a crises sensíveis à banda para rastrear eficientemente os genes associados à epilepsia e explorar os mecanismos subjacentes da epilepsia em nível celular. Implementamos tecidos cerebrais isolados e intactos de Drosophila para imagens de cálcio, o que pode evitar suas técnicas cirúrgicas complexas e preservar a integridade das redes neurais. E a abordagem ex vivo também pode produzir a relação sinal/ruído superior quando comparada com as técnicas de imagem in vivo.

ex-vivo-calcium-imaging-for-drosophila-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

930 visualizações.  the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University. Recentemente, muitos genes candidatos à epilepsia foram encontrados em testes genéticos e, em seguida, prontamente por experimentos animais. Entregamos um conjunto de técnicas para estudar a atividade neural relacionada à epilepsia, incluindo gravação de células inteiras, gravação evocada EPSP e a nova que apresentaremos aqui, a imagem ex vivo de cálcio. Uma vez que a integridade do cérebro e suas redes neurais não podem ser totalmente replicadas em cultura de células ou fatias c...