שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות בשיטה של שדה ממאירות על אפיון של תא ליזום ממאירות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת בסיס לניתוח תפקודי של תאי גזע סרטניים אלה. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב למקום שבו הטיפול של תסמונות myelodysplastic או MDS, כפי שהוא יכול לסייע בזיהוי של המחלה יוזם תאים.
כדי להכין את הנמענים להעברה מאמצת, שבוע לפני ההשתלה לספק מים סטריליים בתוספת 100 מיליגרם לליטר של ציפרופלוקסאצין כדי con genic הנמען בעלי חיים במשך שבעה ימים במתקן מסוים, ללא פתוגן בעלי חיים. ביום השביעי, יש מאומן, מוסמך צסיום 17 מפעיל להגדיר את מכשיר מקור צסיום לספק 70 centigrayS של הקרנה גמא הגוף הכולל לדקה. מניחים 10 עכברים במחזיק מעוצב בהתאמה אישית.
הכנס את המחזיק לתא ההקרנה, לספק 9 אפורים הכולל הקרנה הגוף ב 13 דקות. ואז להחזיר את החיות לכלובים שלהם. למחרת בבוקר, לרסס 70 אחוז אתנול על כל שניים עד שישה עש ישן C57 שחור שישה עכבר ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מהאגן לקרסוליים.
השתמש מדפים עם המספריים כדי להסיר את הירך ואת השוקה. חותכים בצורה נקייה את השרירים מהעצמות. חותכים את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים עבור השוקה ומרים השוקה אחת עם מלקעות.
הכנס מזרק שלושה מיליליטר מצויד מחט 27 gage לתוך חלל מח העצם לשטוף את מח העצם לתוך צינור תחתון עגול 14 מיליליטר המכיל 2.5מיליליטרS של הנקס חיץ תמיסת מלח בתוספת 2% נסיוב חזיר עוברי או HF2. כאשר כל מח העצם נאסף, שאפו את הרקמה מספר פעמים דרך קצה מחט 20 gage כדי לפזר את מסת מח העצם לתוך השעיה אחת לספירה. כדי לתייג את תאי מח העצם הגרעינים, או BMNC, למיון זרימה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגליזציה ולהשעות מחדש את גלולה באחת פעמים עשרה עד BMNC השביעי לכל 90 microliters של ריכוז HF2.
לאחר מכן, מוסיפים עשרה מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטיניילציה נגד שושלת להשעיית התא למשך 20 דקות דגירה ב-4 מעלות צלזיוס. ואחריו שטיפת צנטריפוגה בשלושה מיליליטר של PBS. להשעות מחדש את גלולה ב 100 microliters של HF2 לכל אחד פעמים עשר עד התאים השביעי.
שנית, תייג את התאים עם שני מיקרוליטרים של נוגדן אנטי ביוטין גדיד APC. לאחר 20 מינואים בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור, לשטוף את התאים בשלושה מיליליטר של PBS טרי. להשעות מחדש את גלולה HF2 בתוספת 0.2 מיקרוגרם למיליליטר של יודיד פרופידיום על קרח.
עכשיו לכייל את סדרן תא cytometry זרימה באמצעות תאים נגועים כדי למטב את כל צינורות photomultiplier, פיזור, ופרמטרים פלואורסצנטיים בתוך הטווח ליניארי של כל גלאי. לרכוש שלוש דגימות של 10, 000 תאים עבור תאים APC ללא תווית, PI שכותרתו ואנטי שושלת APC שכותרתו. בסוף המיון, לנתח 1, 000 תאים מכל מדגם כדי לאשר את הטוהר ואת הכדאיות של התאים ממוינים.
תסובב את הדגימות בצנטריפוגה. ואז להשעות את כדורי ב 0.5 מיליליטר של HF2 לספירה. להעברה מאמצת של התאים הממוינים, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של פי שניים מ-BMNC מסוג הבר החמישי מבעל חיים בעל קון ג'יני ב-HF2 סטרילי.
עם 100 מיקרוליטרים של פעמיים עד חמש פעמים עשר עד הרביעי התורם הממוין BMNC של עניין HF2 סטרילי בצינור מיקרו צנטריפוגה לכל בעל חיים הנמען. טען מזרק אחד מיליליטר, מצויד 28 gage לכל נמען עם 200 microliters של תאים. לאחר מכן, מניחים את העכברים המטופל תחת מנורת חום כדי לגרום וריד הזנב תפוגה.
מעבירים את תערובות התאים לכל חיה נמענת מוקרנת קטלנית דרך וריד הזנב. כאשר התחדשות עצמית של תאי גזע מוגבלת לשושלת BMNC שלילית מסוג פראי, שושלת שלילית, שושלת שלילית, חיובית שושלת נמוכה ותאים חיוביים שושלת גבוהה ממוינים ומושתלים לנמענים מסוג פראי כדי לקבוע את יכולת ההתחדשות העצמית של כל אוכלוסיית תא. BMNC טרנס טרנס מושתל מאמץ מבעלי חיים מודל MDS ניתן להבדיל ex vivo על ידי ביטוי סמן משטח התא CD45.2 שלהם.
על ידי 16 שבועות לאחר השתלת שושלת שלילית BNMC, או BMNC ממוין מבעלי חיים תורמים MDS מהודק, התאים מהודק החוצה להתחרות בתאים מסוג הבר כפי שמוצג על ידי אחוז גדל והולך של CD45.2 תאים תורמים חיוביים, נצפה בדם ההיקפי של בעלי חיים הנמען מוקרן קטלנית. כאן מוצגים תאים מטרנספורמציה לויקמית מעכבר המושתל בתאי MDS מהודרים. שים לב לנוכחותם של פיצוצים רבים וצורות לא בוגרות.
בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור להגביל את הזמן של מניפולציה ex vivo, כפי שהוא יכול לשים מתח מופרז על התאים, וכתוצאה מכך מוות תאי או אובדן תפקודי. לאחר התפתחותה טכניקה זו סוללת את הדרך עבור החוקרים בתוכנית השדה, לשים ממאירות לחקור את מקור המחלה בעכברים מהונדסים גנטית.
