אנו מודים לכל חברי פרויקט המחקר, "יצירה משותפת של תכונות אדפטיביות צמחיות באמצעות הרכבה של הולוביונט צמחי-מיקרובי", על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 ו-21H05149 עד A.M. ו-21H05152 ל-Y.T.) ו-Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A. M).

1. גידול צמחים
<ol><li>כדי לשבור תרדמה, להשהות מחדש זרעי A. thaliana (Col-0) במים deionized לדגור אותם ב 4 ° C במשך 4 ימים בחושך.</li>
	<li>לזרוע את הזרעים על הקרקע ולגדול בחדר מצויד אור פלורסנט לבן. שמרו על תנאי הגידול הבאים: טמפרטורה של 22°C, עוצמת אור של 6,000 לוקס (כ-100 μmol/m/m/s) למשך 10 שעות, ולחות יחסית של 60%.</li>
	<li>בעת הצורך, השקו את הצמחים בדשן נוזלי. יש להימנע מהשקיה משבוע עד יומיים לפני החיסון ולהשקות היטב יום אחד לפני החיסון.</li>
</ol>2. הכנת חיסון חיידקי
<ol><li>פס Pto ממלאי גליצרול על מדיום King's B (KB) מוצק (20 גרם טריפטון, 1.5 גרם K2HPO4, ו 15 גרם גליצרול עבור 1 ליטר, 1.5% אגר) עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ריפמפיצין ולדגור ב 28 ° C במשך יומיים.</li>
	<li>יש לחסן מושבה בודדת עד 5 מ"ל של מדיום נוזלי KB עם ריפמפיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל ולדגור ב-28°C עם ניעור ב-200 סל"ד עד לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר.</li>
	<li>צנטריפוגו את התרבית ב 6,000 x גרם במשך 2 דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מים סטריליים. חזור על שלב זה פעם נוספת.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב- 1 מ"ל של חיץ פתיחת הפיוניות (25 mM MES-KOH pH 6.15, 10 mM KCl), ומדוד את OD600.</li>
	<li>דללו את המתלה ל-OD600 0.2 עם חיץ פתיחת פיוניות המכיל 0.04% סיליקון פעילי שטח.</li>
</ol>3. חיסון ריסוס של חיידקים
<ol><li>מיום אחד לפני החיסון ועד סוף הניסוי, יש לחשוף את הצמחים לעוצמת אור של כ-10,000 לוקס (כ-170 מיקרומול/מ"ר2/שנייה).</li>
	<li>כדי להבטיח שרוב הפיוניות פתוחות, יש לשמור את הצמחים על מגש מכוסה במכסה שקוף מתחת לאור לפחות 3 שעות לפני החיסון בריסוס.</li>
	<li>הסירו את המכסה והשתמשו במברשת אוויר כדי לרסס את הצד האבקסיאלי של העלים בתרחיף חיידקי של 2.5 מ"ל לכל שלושה צמחים על עציץ אחד.</li>
	<li>דגרו על הצמחים המחוסנים על מגש מכוסה במכסה שקוף כדי לשמור על לחות יחסית של כ-85%.</li>
	<li>רכוש תמונות של פיוניות בשעה אחת ושלוש שעות לאחר חיסון בתרסיס בשיטה המתוארת בסעיף 4.</li>
</ol>4. תצפית ישירה על הפיוניות באמצעות מכשיר הדימות הנייד
הערה: התקן ההדמיה הסטומטלית הנייד מצויד באור LED ובמודול מצלמה ויכול לרכוש 2,592 תמונות × 1,944 (גובה × רוחב; פיקסלים) ברזולוציה של כ- 0.5 מיקרומטר לפיקסל.
<ol><li>חבר את התקן ההדמיה הסטומטלית הנייד למחשב אישי (PC) המצויד בתוכנה לרכישת תמונה.</li>
	<li>מוציאים בעדינות אך לחלוטין טיפות מים מהעלים המחוסנים בעזרת פיסת נייר.</li>
	<li>פתחו את הכיסוי העליון של המכשיר, הניחו את העלה על הבמה וסגרו את הכיסוי העליון (איור 1).</li>
	<li>כוונן את מוקד התמונה על-ידי מניפולציה של בורג הכוונן, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שמור תמונה במסך המחשב. התמונה תירכש באופן מיידי. בדרך כלל, תמונה ממוקדת מכילה כ-10 פיוניות הניתנות לניתוח. כדי לקבל תוצאות חזקות, רכשו תמונות סטומטליות משישה עלים של שלושה צמחים שונים (שני עלים לכל צמח).</li>
</ol>5. מדידה ידנית של צמצם סטומטלי
הערה: ניתן להוריד את תוכנת ImageJ בכתובת https://imagej.nih.gov/ij/download.html
<ol><li>פתח קובץ תמונה ב- ImageJ.</li>
	<li>פתח את מנהל החזר ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות נתח כלי > > מנהל החזר ההשקעה.</li>
	<li>השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי לצייר קו המתאים לרוחב הסטומה (איור 2) ולרשום את החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף במנהל החזר ההשקעה.</li>
	<li>צייר קו המתאים לאורך אותה סטומה (איור 2A) ורשום את החזר ההשקעה כמתואר בשלב 5.3.</li>
	<li>לחץ על מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי למדוד את הרוחב והאורך.</li>
	<li>חלק את הרוחב באורך כדי לקבל את הצמצם הסטומטלי (יחס). לכימות חזק, השתמש ב- 60 פיוניות או יותר עבור כל טיפול ונקודת זמן. אל תבחרו פיוניות מוקדמות או מעורפלות לניתוח (איור 2B, C).</li>
</ol>6. מדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי
הערה: צינור ניתוח התמונות פועל ב- Google Colaboratory, סביבת הפעלה של שפת תכנות Python בענן. למשתמשים חייב להיות חשבון Google חוקי עם כונן Google פעיל, דפדפן Google Chrome וחיבור אינטרנט יציב כתנאי מוקדם.
<ol><li>הורד את המחשב הנייד Google Colaboratory מ-Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ופתח את המחברת.</li>
	<li>צור עותק מקומי של המחשב הנייד ב-Google Drive על ידי לחיצה על קובץ > שמירת עותק ב-Drive. לאחר הופעת כרטיסיה חדשה, סגור בבטחה את הכרטיסיה של המחברת המקורית.</li>
	<li>לחץ על לחצן הפעל פעם אחת מתחת למקטע הגדרת סביבה במחברת מבלי לפתוח את בלוקי התאים כדי לייבא את הספריות הדרושות.</li>
	<li>הפעילו את המקטע 'הגדרות ספרייה ' כדי ליצור שלוש תיקיות המשמשות לניתוח (למשל, example_result, inference_results ודגם) ב-Google Drive. הערה: במקרה זה, התיקיות הנקראות example_result, inference_results ו - model משמשות כספריית הורים, המאחסנות תוצאות הסקה ומודלים מאומנים, בהתאמה. מחברת זו מציגה דוגמה לבניית ספריות כהליך מייצג. כדי לשנות את השם, כתוב מחדש את הנתיב pardir, infdir או modeldir .</li>
	<li>על פי החלק הכנת התמונות , העבר את התמונות שנרכשו ל- example_result, מקובצות בכותרות תמונות לפי טיפול או מדגם (למשל, mock_1h_XXXXXX.jpg) עבור יצירת הגרף הסופי. תמונות לדוגמה זמינות באתר Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).</li>
	<li>בצע את החלק הורד מודלים מאומנים כדי להוריד את קבצי ONNX של הדגמים המאומנים מ- Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ולמקם אותם תחת ספריית הדגמים .</li>
	<li>הפעל את החלק Inference and Measurement of Stomatal Aperture כדי לכמת את הצמצם הסטומטלי מתמונות בודדות. תמונות התוצאה עם הסקה שכבת-על וקובץ csv בשם example_result.csv ייוצאו לספריית inference_results.</li>
	<li>הפעילו את המקטע 'יצירת תרשימים ' ליצירת גרף על יחס הצמצם הסטומטי, המיוצא לספריית inference_results .</li>
</ol>

מדידת תגובה סטומטית אוטומטית לפלישת חיידקים בארבידופסיס

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים 9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאח?...

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,3,4,5,6. לדוגמה, ניתן להשתמש בפורומטר כדי למדוד את קצב השעתוק כמדד של מוליכות סטומטלית. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע ישיר על מספר הסטומטלית והצמצם הקובעים את המוליכות הסטומטלית. מחקרים מסוימים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית המדגישות נקבוביות סטומאטליות באמצעות סמן אקטין פלואורסצנטי, צבע פלואורסצנטי או אוטופלואורסצנטיות של דופן התא 1,2,3,4,5. בעוד שגישות אלה מקלות על איתור פיוניות, העלות הן של הפעלת מתקן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן של הכנת דגימות מיקרוסקופיה יכולה להוות מכשול ליישום שגרתי. בעבודה פורצת דרך של סאי ואחרים, פותח מודל רשת עצבית עמוקה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי מתמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר של קליפות אפידרמיס A. thaliana 6. עם זאת, חידוש זה אינו פוטר חוקרים מהמשימה של הכנת קליפת אפידרמיס לתצפית מיקרוסקופית. לאחרונה, התגברו על מכשול זה על ידי פיתוח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה של A. thaliana, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה המודד באופן אוטומטי צמצם סטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר7.
סטומטות תורמות לחסינות מולדת של הצמח מפני פתוגנים חיידקיים. המפתח לתגובה חיסונית זו הוא סגירה סטומטית המגבילה את כניסת החיידקים דרך הנקבובית המיקרוסקופית אל פנים העלה, שם פתוגנים חיידקיים מתרבים וגורמים למחלות8. סגירה סטומטית נגרמת על ידי זיהוי של דפוסים מולקולריים הקשורים למיקרובים (MAMPs), מולקולות אימונוגניות המשותפות לעתים קרובות לסוג של מיקרובים, על ידי קולטני זיהוי תבניות מקומיות של קרום פלזמה (PRR)9. אפיטופ של 22 חומצות אמינו של שוטון חיידקי המכונה flg22 הוא MAMP טיפוסי הגורם לסגירה סטומטית באמצעות זיהויו על ידי PRR FLS210. כאמצעי נגד, פתוגנים חיידקיים כגון מזרקי Pseudomonas pv. עגבניה DC3000 (Pto) ו-Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria פיתחו מנגנוני אלימות כדי לפתוח מחדש פיוניות 9,11,12. תגובות סטומאטליות אלה לפתוגנים חיידקיים נותחו באופן קונבנציונלי בבדיקות שבהן קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים טבעית המתרחשת בעלה המחובר לצמח.
כאן, מוצגת שיטה פשוטה לחקור סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto במצב המחקה באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים. שיטה זו ממנפת את מכשיר ההדמיה הנייד לתצפית ישירה על פיוניות A. thaliana על עלה המחובר לצמח המחוסן ב-Pto, יחד עם צינור ניתוח התמונה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

מחבר זרקור: קידום מחקר סטומטלי עם מדידת צמצם אוטומטית

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

לאחר חיסון ריסוס של Pto, פיוניות על עלים המחוברים לצמחים המחוסנים נצפו ישירות על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. באמצעות מדידות ידניות ואוטומטיות, אותן תמונות עלים שימשו לחישוב צמצם סטומטלי על ידי לקיחת יחסים של רוחב לאורך של כ -60 פיוניות. מדידות ידניות ואוטומטיות הצביעו באופן עקבי על יר?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

לפיוניות צמחיות יש תפקיד מרכזי בהסתגלות לתנאי עקה, ולכן עלינו למדוד את צמצם הפיוניות כדי להבין כיצד צמחים מגיבים לעקות ביוטיות וא-ביוטיות. עם זאת, מדידת צמצם הפיוניות גוזלת זמן ומסורבלת. כדי למדוד את צמצם הפיוניות, אנו מקלפים את האפידרמיס ומתבוננים בפיוניות תחת מיקרוסקופ.לאחר מכן אנו מודדים ידנית את צמצם הפיוניות, דבר שלוקח זמן רב אפילו לחוקרים מנוסים מאוד. אתגרנו את המחסומים הללו ופיתחנו כלי וטכניקה שיכולים למדוד אוטומטית את צמצם הפיוניות בעלי ארבידופסיס שלמים. לכן אנו מאמינים כי מכשיר מדידת הפיוניות ואלגוריתם הלמידה העמוקה שפיתחנו יאפשרו ניתוח פונקציונלי של תגובות הפיוניות לעקות ביוטיות וא-ביוטיות שונות, מכיוון שההתקדמות הטכנית הזו מפחיתה באופן משמעותי את הזמן והעבודה האנושית הנדרשים למדידת צמצם הפיוניות.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

1.2K Views.  Kyoto University. לפיוניות צמחיות יש תפקיד מרכזי בהסתגלות לתנאי עקה, ולכן עלינו למדוד את צמצם הפיוניות כדי להבין כיצד צמחים מגיבים לעקות ביוטיות וא-ביוטיות. עם זאת, מדידת צמצם הפיוניות גוזלת זמן ומסורבלת. כדי למדוד את צמצם הפיוניות, אנו מקלפים את האפידרמיס ומתבוננים בפיוניות תחת מיקרוסקופ.

Video: מחבר זרקור: קידום מחקר סטומטלי עם מדידת צמצם אוטומטית

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

אינדוקציה של מזרקי Pseudomonas pv. עגבניה זיהום DC3000 ב- Arabidopsis thaliana למדידת תגובה סטומטית אוטומטית

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection