Agradecemos a todos los miembros del proyecto de investigación, 'Co-creación de rasgos adaptativos de plantas a través del ensamblaje de holobiontes planta-microbio', por las fructíferas discusiones. Este trabajo fue apoyado por Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 y 21H05149 a A.M. y 21H05152 a Y.T.) y Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 a A. M.).

1. Cultivo de plantas
<ol><li>Para romper la latencia, resuspender las semillas de A. thaliana (Col-0) en agua desionizada e incubarlas a 4 °C durante 4 días en la oscuridad.</li>
	<li>Siembre las semillas en el suelo y crezca en una cámara equipada con luz fluorescente blanca. Mantener las siguientes condiciones de crecimiento: temperatura de 22 °C, intensidad lumínica de 6.000 lux (aprox. 100 μmol/m2/s) durante 10 h y humedad relativa del 60%.</li>
	<li>Cuando sea necesario, riegue las plantas con un fertilizante líquido. Abstenerse de regar de 1 semana a 2 días antes de la inoculación y regar bien 1 día antes de la inoculación.</li>
</ol>2. Preparación del inóculo bacteriano
<ol><li>Estrías de Pto a partir de caldo de glicerol en medio solidificado King's B (KB) (20 g de triptona, 1,5 g de K2HPO4 y 15 g de glicerol para 1 L, agar al 1,5%) con 50 μg/ml de rifampicina e incubar a 28 °C durante 2 días.</li>
	<li>Inocular una sola colonia a 5 mL de medio líquido KB con 50 μg/mL de rifampicina e incubar a 28 °C con agitación a 200 rpm hasta la fase de crecimiento logarítmico tardío.</li>
	<li>Centrifugar el cultivo a 6.000 x g durante 2 min, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de agua estéril. Repita este paso una vez más.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de tampón de apertura de los estomas (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) y mida el OD600.</li>
	<li>Diluir la suspensión a DO600 0,2 con tampón de apertura de los estomas, que contiene un 0,04 % de tensioactivo de silicona.</li>
</ol>3. Inoculación por pulverización de bacterias
<ol><li>Desde 1 día antes de la inoculación hasta el final del experimento, exponga las plantas a una intensidad de luz de unos 10.000 lux (aprox. 170 μmol/m2/s).</li>
	<li>Para asegurarse de que la mayoría de los estomas estén abiertos, mantenga las plantas en una bandeja cubierta con una tapa transparente bajo la luz durante al menos 3 horas antes de la inoculación por pulverización.</li>
	<li>Retire la tapa y use un aerógrafo para rociar el lado abaxial de las hojas con 2,5 ml de suspensión bacteriana por cada tres plantas en una sola maceta.</li>
	<li>Incubar las plantas inoculadas en una bandeja cubierta con una tapa transparente para mantener una humedad relativa de alrededor del 85%.</li>
	<li>Adquirir imágenes de los estomas a la 1 h y 3 h después de la inoculación por pulverización utilizando el método descrito en la sección 4.</li>
</ol>4. Observación directa de los estomas mediante el dispositivo portátil de imagen
NOTA: El dispositivo portátil de imágenes estomáticas está equipado con una luz LED y un módulo de cámara y puede adquirir imágenes de 2.592 × 1.944 (altura × anchura; píxeles) con una resolución de aproximadamente 0,5 μm/píxel.
<ol><li>Conecte el dispositivo portátil de imágenes estomáticas a una computadora personal (PC) equipada con software de adquisición de imágenes.</li>
	<li>Retire suave pero completamente las gotas de agua de las hojas inoculadas con un trozo de papel.</li>
	<li>Abra la cubierta superior del dispositivo, coloque la hoja en la platina y cierre la cubierta superior (Figura 1).</li>
	<li>Ajuste el enfoque de la imagen manipulando el tornillo de ajuste y, a continuación, haga clic en el botón Guardar imagen en la pantalla del PC. La imagen se adquirirá al instante. Por lo general, una imagen enfocada contiene aproximadamente 10 estomas analizables. Para obtener resultados robustos, adquiera imágenes estomáticas de seis hojas de tres plantas diferentes (dos hojas por planta).</li>
</ol>5. Medición manual de la apertura estomática
NOTA: El software ImageJ se puede descargar en https://imagej.nih.gov/ij/download.html
<ol><li>Abra un archivo de imagen en ImageJ.</li>
	<li>Abra el administrador de ROI seleccionando Analizar herramientas de > > Administrador de ROI.</li>
	<li>Utilice la herramienta de selección Línea recta para dibujar una línea correspondiente a la anchura de un estoma (Figura 2) y registre el ROI haciendo clic en Agregar en el Administrador de ROI.</li>
	<li>Dibuje una línea correspondiente a la longitud del mismo estoma (Figura 2A) y registre el ROI como se describe en el paso 5.3.</li>
	<li>Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para medir el ancho y el largo.</li>
	<li>Divida el ancho por el largo para obtener la apertura estomática (proporción). Para una cuantificación robusta, use 60 o más estomas para cada tratamiento y punto de tiempo. No elija estomas prematuros u oscuros para el análisis (Figura 2B, C).</li>
</ol>6. Medición automatizada de la apertura estomática
NOTA: La canalización de análisis de imágenes se ejecuta en Google Colaboratory, un entorno ejecutable de lenguaje de programación Python en la nube. Los usuarios deben tener una cuenta de Google válida con un Google Drive, un navegador Google Chrome que funcione y una conexión a Internet estable como requisito previo.
<ol><li>Descargue el cuaderno de Google Colaboratory de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) y ábralo.</li>
	<li>Para realizar una copia local del bloc de notas en Google Drive, selecciona Archivo > Guardar una copia en Drive. Después de que aparezca una nueva pestaña, cierre de forma segura la pestaña del bloc de notas original.</li>
	<li>Presione el botón Ejecutar una vez debajo de la sección Configuración del entorno en el cuaderno sin desplegar los bloques de celdas para importar las bibliotecas requeridas.</li>
	<li>Ejecute la sección Configuración del directorio para crear tres carpetas utilizadas para el análisis (por ejemplo, example_result, inference_results y modelo) en Google Drive. NOTA: En este caso, las carpetas denominadas example_result, inference_results y model se utilizan como directorio principal, almacenando los resultados de la inferencia y los modelos entrenados, respectivamente. En este cuaderno se muestra un ejemplo de construcción de directorios como procedimiento representativo. Para cambiar el nombre, vuelva a escribir la ruta pardir, infdir o modeldir .</li>
	<li>De acuerdo con la sección Preparación de las imágenes , mueva las imágenes adquiridas a example_result, agrupadas en títulos de imágenes por tratamiento o muestra (por ejemplo, mock_1h_XXXXXX.jpg) para la generación final de gráficos. Las imágenes de muestra están disponibles en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).</li>
	<li>Realice la parte Descargar modelos entrenados para descargar los archivos ONNX de los modelos entrenados de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) y colóquelos en el directorio del modelo .</li>
	<li>Ejecute la parte Inferencia y medición de la apertura estomática para cuantificar la apertura estomática a partir de imágenes individuales. Las imágenes resultantes con inferencia superpuesta y el archivo csv denominado example_result.csv se exportarán al directorio inference_results.</li>
	<li>Ejecute la sección Generación de grafos para crear un gráfico sobre la relación de apertura estomática, exportado al directorio inference_results .</li>
</ol>

Medición automatizada de la respuesta estomática a la invasión bacteriana en Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Estudios previos utilizaron cáscaras epidérmicas, discos foliares u hojas desprendidas para investigar las respuestas estomáticas a las invasiones bacterianas 9,11,12. Por el contrario, el método propuesto en este estudio aprovecha el dispositivo portátil de imágenes estomáticas para observar directamente los estomas en una hoja adherida a la planta después de la inoculación por aspersión de Pto, imitando las ...

Los estomas son poros microscópicos rodeados por un par de células protectoras en la superficie de las hojas y otras partes aéreas de las plantas. En entornos en constante cambio, la regulación de la apertura estomática es fundamental para que las plantas controlen la absorción de dióxido de carbono necesaria para la fotosíntesis a expensas de la pérdida de agua a través de la transpiración. Por lo tanto, la cuantificación de la apertura estomática ha sido fundamental para comprender la adaptación ambiental de las plantas. Sin embargo, cuantificar la apertura estomática es inherentemente lento y engorroso, ya que requiere trabajo humano para detectar y medir los poros de los estomas en una imagen de hoja capturada por un microscopio. Para sortear estas limitaciones, se han desarrollado diversos métodos para facilitar la cuantificación de la apertura estomática en Arabidopsis thaliana, una planta modelo ampliamente utilizada para estudiar la biología estomática 1,2,3,4,5,6. Por ejemplo, se puede utilizar un porómetro para medir la tasa de transpiración como medida de la conductancia estomática. Sin embargo, este método no proporciona información directa sobre el número y la apertura de los estomas que determinan la conductancia estomática. Algunos estudios han utilizado técnicas de microscopía confocal que resaltan los poros de los estomas utilizando un marcador de actina fluorescente, un colorante fluorescente o autofluorescencia de la pared celular 1,2,3,4,5. Si bien estos enfoques facilitan la detección de estomas, el costo de operar una instalación de microscopía confocal y preparar muestras de microscopía puede ser un obstáculo para la aplicación rutinaria. En un trabajo pionero de Sai et al., se desarrolló un modelo de red neuronal profunda para medir automáticamente la apertura estomática a partir de imágenes microscópicas de campo claro de exfoliaciones epidérmicas de A. thaliana 6. Sin embargo, esta innovación no exime a los investigadores de la tarea de preparar un peeling epidérmico para su observación microscópica. Recientemente, este obstáculo se superó mediante el desarrollo de un dispositivo de imagen portátil que puede observar los estomas pellizcando una hoja de A. thaliana, junto con una tubería de análisis de imágenes basada en el aprendizaje profundo que mide automáticamente la apertura de los estomas a partir de imágenes de hojas capturadas por el dispositivo7.
Los estomas contribuyen a la inmunidad innata de las plantas contra los patógenos bacterianos. La clave de esta respuesta inmune es el cierre estomatológico que restringe la entrada bacteriana a través del poro microscópico hacia el interior de la hoja, donde los patógenos bacterianos proliferan y causan enfermedades8. El cierre de los estomas se induce tras el reconocimiento de patrones moleculares asociados a microbios (MAMP), moléculas inmunogénicas que a menudo son comunes a una clase de microbios, por parte de los receptores de reconocimiento de patrones localizados en la membrana plasmática (PRR)9. Un epítopo de 22 aminoácidos de la flagelina bacteriana conocido como flg22 es un MAMP típico que induce el cierre de los estomas a través de su reconocimiento por el PRR FLS210. Como contramedida, los patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) y Xanthomonas campestris pv. Las vesicatorias han desarrollado mecanismos de virulencia para reabrir los estomas 9,11,12. Estas respuestas estomáticas a patógenos bacterianos se han analizado convencionalmente en ensayos en los que las cáscaras epidérmicas de las hojas, los discos de las hojas o las hojas desprendidas flotan en suspensión bacteriana, y luego los estamatas se observan bajo un microscopio seguido de una medición manual de la apertura de los estomas. Sin embargo, estos ensayos son engorrosos y pueden no reflejar las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana natural que se produce en una hoja adherida a la planta.
Aquí, se presenta un método simple para investigar el cierre y la reapertura de los estomas durante la invasión de la toma de fuerza bajo la condición que imita de cerca la interacción natural planta-bacteria. Este método aprovecha el dispositivo de imagen portátil para la observación directa de los estomas de A. thaliana en una hoja adherida a la planta inoculada con Pto, junto con la tubería de análisis de imágenes para la medición automatizada de la apertura de los estomas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Los estomas son poros microscópicos que se encuentran en la epidermis de las hojas de las plantas. La regulación de la apertura estomática es fundamental no solo para equilibrar la absorción de dióxido de carbono para la fotosíntesis y la pérdida transpiracional de agua, sino también para restringir la invasión bacteriana. Mientras que las plantas cierran los estomas al reconocer los microbios, las bacterias patógenas, como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto), vuelva a abrir los estomas cerrados para acceder al interior de la hoja. En los ensayos convencionales para evaluar las respuestas de los estomas a la invasión bacteriana, las cáscaras epidérmicas de las hojas, los discos de las hojas o las hojas desprendidas flotan en suspensión bacteriana, y luego los estomas se observan bajo un microscopio seguido de una medición manual de la apertura de los estomas. Sin embargo, estos ensayos son engorrosos y es posible que no reflejen las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana natural en una hoja adherida a la planta. Recientemente, se desarrolló un dispositivo de imagen portátil que puede observar los estomas pellizcando una hoja sin separarla de la planta, junto con una tubería de análisis de imágenes basada en el aprendizaje profundo diseñada para medir automáticamente la apertura de los estomas a partir de imágenes de hojas capturadas por el dispositivo. Aquí, sobre la base de estos avances técnicos, se presenta un nuevo método para evaluar las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana . Este método consta de tres sencillos pasos: inoculación por pulverización de Pto imitando los procesos naturales de infección, observación directa de los estomas en una hoja de la planta inoculada con Pto utilizando el dispositivo portátil de obtención de imágenes y medición automatizada de la apertura estomática mediante la tubería de análisis de imágenes. Este método se utilizó con éxito para demostrar el cierre y la reapertura de los estomas durante la invasión de la toma de fuerza en condiciones que imitan de cerca la interacción natural planta-bacteria.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Autor destacado: Avance de la investigación estomática con la medición automatizada de la apertura

Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Después de la inoculación por aspersión de Pto, los estomas en las hojas adheridas a las plantas inoculadas fueron observados directamente por el dispositivo portátil de imágenes estomáticas. Utilizando mediciones manuales y automatizadas, se utilizaron las mismas imágenes de las hojas para calcular la apertura de los estomas tomando proporciones de ancho a largo de aproximadamente 60 estomas. Las mediciones manuales y automatizadas indicaron consistentemente una disminución en la apertura estomática en...

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Aquí, presentamos un método simple para la observación directa y la medición automatizada de las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana. Este método aprovecha un dispositivo portátil de imágenes estomáticas, junto con una canalización de análisis de imágenes diseñada para imágenes foliares capturadas por el dispositivo.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Los estomas vegetales desempeñan un papel central en la adaptación a las condiciones de estrés, por lo que necesitamos medir la apertura de los estomas para comprender cómo responden las plantas al estrés biótico y abiótico. Sin embargo, la medición de la apertura de los estomas requiere mucho tiempo y es engorrosa. Para medir la apertura de los estomas, pelamos la epidermis y observamos los estomas bajo un microscopio.A continuación, medimos manualmente la apertura de los estomas, lo que lleva mucho tiempo incluso para investigadores muy experimentados. Desafiamos estas barreras y desarrollamos una herramienta y una técnica que puede medir automáticamente la apertura de los estomas en hojas intactas de Arabidopsis. Por lo tanto, creemos firmemente que el dispositivo de medición de estomas y el algoritmo de aprendizaje profundo que desarrollamos facilitarán el análisis funcional de las respuestas de los estomas a diversos estreses bióticos y abióticos, ya que estos avances técnicos reducen significativamente el tiempo y la mano de obra humana necesarios para la medición de la apertura de los estomas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

1.2K vistas.  Kyoto University. Los estomas vegetales desempeñan un papel central en la adaptación a las condiciones de estrés, por lo que necesitamos medir la apertura de los estomas para comprender cómo responden las plantas al estrés biótico y abiótico. Sin embargo, la medición de la apertura de los estomas requiere mucho tiempo y es engorrosa. Para medir la apertura de los estomas, pelamos la epidermis y observamos los estomas bajo un microscopio.A continuación, medimos manualmente la apertura de los est...

Video: Autor destacado: Avance de la investigación estomática con la medición automatizada de la apertura

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Inducción de Pseudomonas syringae pv. tomate Infección por DC3000 en Arabidopsis thaliana para la medición automatizada de la respuesta estomática

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection

Medición automatizada de la respuesta estomática en Arabidopsis thaliana en respuesta a Pseudomonas syringae pv. tomate Infección por DC3000