מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (2022CFC057).

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'יאנגהאן ונערך בהתאם להנחיות אתיות של חיות ניסוי שהונפקו על ידי המרכז לבקרת מחלות של סין. עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים, בני 10 שבועות, משוקללים 24-26 גרם, שימשו בפרוטוקול זה. כל העכברים שוכנו בסביבה מבוקרת של 12 שעות במחזור אור/חושך עם מזון ומים עד ליביטום.
1. הכנה טרום ניתוחית
הערה: המכשירים והציוד העיקריים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים באיור 1.
<ol><li>לפני ההליך, לעקר את כלי הניתוח על ידי autoclaving.</li>
	<li>מתן meloxicam תת עורית במינון של 5 מ"ג / ק"ג עבור שיכוך כאבים 60 דקות לפני הניתוח.</li>
	<li>מרדימים את העכבר עם 5% isoflurane בתא אינדוקציה.</li>
	<li>נגבו את לוח ניתוח החימום באתנול 75% והפעילו את מתג החימום כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37°C. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב צדדי שמאלי על הלוח, כאשר הראש ממוקם הרחק מהמנתח והזנב פונה לכיוון המנתח.</li>
	<li>חבר מסכה לפני העכבר המספקת אספקה קבועה של 2% איזופלורן ו-0.3 ליטר/דקה חמצן להרדמה תחזוקתית. החל את משחת העין על הקרנית כדי להגן עליהם מפני ייבוש במהלך ההליך.</li>
	<li>לגלח את הפרווה מהמסלול השמאלי לתעלת האוזן השמאלית עם מכונת גילוח. השתמש קרמים depilatory כדי להסיר את הפרווה שנותרה לעיקור.</li>
	<li>הכינו את אזור הניתוח על ידי מריחת חומר חיטוי פובידון-יוד ואתנול 75% שלוש פעמים.</li>
</ol>2. דגם MCAO דיסטלי
<ol><li>בדוק אם העכבר מורדם עמוקות על ידי הערכת הרפלקסים של צביטת הבוהן.</li>
	<li>בצע חתך אנכי בין המסלול השמאלי לתעלת האוזן השמאלית באמצעות להב אזמל סטרילי.</li>
	<li>משכו את הרקמה הרכה של העור עם retractors וחשפו את השריר הרקתי.</li>
	<li>השתמש microforceps ישר כדי להפריד את המקטעים apical ו dorsal של השריר הרקתי מן הגולגולת.</li>
	<li>זהו את הביפורקציה של ה-MCA, אשר לובשת צורה "Y" מתחת לעצם הרקתית עם הטיה לכיוון בסיס הגולגולת (איור 2A). הערה: אם הביפורקציה של MCA אינה נראית לעין (עקב וריאציה אנטומית נורמלית), ודא את כלי השיט הרוסטרלי ביותר.</li>
	<li>השתמש מקדח גולגולת חשמלי כדי לדלל את הגולגולת כדי ליצור חלון עצם (4 מ"מ קוטר) עד דורה מאטר, עם מרקם שקוף, הופך גלוי. הערה: יש להוסיף לסירוגין טיפות של מי מלח רגילים לגולגולת כדי למנוע התחממות יתר במהלך תהליך זה.</li>
	<li>הסר את הדורה מאטר מעל העורק עם מלקחיים מיקרו מעוקלים כדי לחשוף את ענף MCA.</li>
	<li>כוונו את העורק ל-7W. קרשו את העורק באמצעות מלקחיים חשמליים בקרישה באתרים של פרוקסימלי ודיסטלי לביפורקציה של MCA (איור 2A). כאשר הביפורקציה אינה נראית לעין עקב שונות אנטומית, יש לבצע את הקרישה על ענף MCA שזוהה במדויק (כאמור לעיל) בשני מקומות נפרדים במרחק של כ-1 מ"מ זה מזה13.</li>
	<li>עקוב אחר זרימת הדם של ענף קליפת המוח השמאלי MCA באמצעות מד זרימת דם בלייזר. הערה: עכברים המציגים ירידה בזרימת הדם של פחות מ -40% מהערך הבסיסי לאחר אלקטרוקואגולציה לא נכללו במחקר.</li>
	<li>תפרו את השריר והעור בנפרד באמצעות 5-0 תפרים של חומצה פוליגליקולית. החל דיקלופנק נתרן ג'ל משחה mupirocin על חתך העור באמצעות צמר גפן סטרילי.</li>
	<li>הנח את העכבר בתא שחזור. עקוב אחר כל העכברים עד שהם ערים לחלוטין. לספק meloxicam (5 מ"ג / ק"ג, SC) עבור שיכוך כאבים כל 24 שעות עד 72 שעות.</li>
</ol>3. מבצע דאם
<ol><li>לשחזר את אותו הליך כמו אלה שהוזכרו לעיל, למעט תהליך של קרישת עורק.</li>
</ol>4. מבחנים התנהגותיים
הערה: לפני dMCAO, העכברים עברו אימון התנהגותי פעמיים ביום במשך 3 ימים. ביוםהשלישי לאחר dMCAO, העבירו את העכברים לחדר הבדיקות ההתנהגותיות להסתגלות סביבתית של שעתיים לפני הבדיקה.
<ol><li>מבחן חוזק אחיזה14 הערה: מד חוזק האחיזה כולל מד מאמץ דחיפה-משיכה ומוט אופקי ממתכת.<ol><li>אחזו בבסיס זנב העכבר. הורידו בהדרגה את העכבר לכיוון מוט האחיזה המתכתי עד שהוא אוחז במוט האופקי עם שתי הכפות הקדמיות (איור 2B).</li>
		<li>משוך את העכבר לאחור במהירות קבועה של כ-2 ס"מ לשנייה ושמור על גופו אופקי.</li>
		<li>רשום את כוח השיא בגרמים (g) כאשר העכבר משחרר את כפותיו הקדמיות מהמוט.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן קוטב15<ol><li>הניחו את העכבר על ראש מוט עץ אנכי (50 ס"מ גובה, 1 ס"מ קוטר) כשראשו פונה כלפי מעלה, ואפשרו לו לטפס במורד המוט (איור 2B).</li>
		<li>רשום את הזמן שלוקח לעכבר להסתובב (סיבוב T) ואת הזמן הכולל לטפס במורד המוט (T-total) עם זמן חיתוך של 60 שניות.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת הסרת סרט הדבקה16<ol><li>החזיקו את העכבר וחברו טלאי של סרט הדבקה (2 × 2 מ"מ) לכפה הקדמית הימנית של העכבר (איור 2B).</li>
		<li>החזירו את העכבר לכלוב הגידול ואפשרו לו לנוע בחופשיות.</li>
		<li>רשום את הזמן שלקח לעכבר להסיר דבק עם מגבלה של 60 שניות.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת צילינדר17<ol><li>הניחו את העכבר בתוך גליל זכוכית פתוח ושקוף (קוטר: 14 ס"מ; גובה: 20 ס"מ) ותיעדו את התנהגות הגישוש הספונטנית שלו בעמידה במשך 3 דקות באמצעות מצלמה (איור 2B). הערה: במהלך הליך הניסוי, שתי מראות הוצבו לצד הצילינדר כדי להבטיח רישום אופטימלי של תנועות הגפיים הקדמיות.</li>
		<li>נגב את הגליל עם אתנול 75% כדי למנוע שאריות של רמזי ריח לפני בדיקת העכבר הבא.</li>
		<li>הפחת את מהירות ההפעלה של הווידאו ל -1/5 מהמהירות בפועל, וספור את מספר נגיעות הקיר עם הכף הקדמית השמאלית (L) או הימנית (R) או שימוש בו זמנית בשתי הכפות הקדמיות (B). חשב את שיעור השימוש של הכף הקדמית הימנית כ- (L-R)/(L + R + B) × 100%.</li>
	</ol></li>
</ol>5. זילוח והכנת מדגם
<ol><li>המתת חסד העכבר על ידי מנת יתר של הזרקת הצפק של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג). מקם את העכבר בשכיבה ולשתק את הגפיים.</li>
	<li>בצע חתך קו אמצע על העור, החל מחלל אמצע הבטן ונמשך לכיוון אזור החזה העליון.</li>
	<li>פתח את החזה באמצעות מספריים כירורגיים וקפל את הקסיפואיד כלפי מעלה באמצעות המוסטט. בזהירות להסיר את הריאה ואת הסרעפת כדי לחשוף את הלב.</li>
	<li>הכנס את קצה מחט הזלוף לחדר השמאלי ונקב את אטריום ימין עם מספריים. לערבב את הלב עם 20 מ"ל של מלוחים נורמליים דרך החדר השמאלי.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר וחתכו את הקרקפת לאורך קו האמצע שבין העיניים. חותכים את העצם לאורך שני הצדדים, החל מבסיס הגולגולת ונפתחים לארובת העין.</li>
	<li>הרימו את הקלבריום ונתקו בעדינות את המוח מבסיס הגולגולת באמצעות מלקחיים. הערה: מוחות של מחצית מהעכברים היו נתונים לצביעה של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC), בעוד שמוחות מהחצי השני עברו בדיקה היסטולוגית.</li>
	<li>השרו את המוח בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך הלילה לצורך ניתוח היסטולוגי המשך.</li>
</ol>6. זיהוי נפח אוטם
<ol><li>הכניסו את המוח לתא הקפאה בטמפרטורה של -20°C במקרר למשך 20 דקות.</li>
	<li>מקמו את המוח לתוך מטריצת המוח בקוטר 1 מ"מ וחתכו את המוח למקטעים כליליים בעובי של 2 מ"מ באמצעות להבי מיקרוטום.</li>
	<li>העבירו את חלקי המוח לצלחת תרבית של 24 בארות והוסיפו 2% TTC כדי לכסות את רקמת המוח. שים את צלחת תרבית 24 בארות בתנור טמפרטורה קבועה במשך 30 דקות עם הטמפרטורה להגדיר על 37 ° C.</li>
	<li>הרימו בזהירות את חלקי המוח וקיבעו אותם בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות.</li>
	<li>בצע סריקה אופטית של חלקי מוח אלה ברזולוציה של 1200 x 1200 dpi על ידי סורק.</li>
	<li>מדוד את נפח אוטם המוח על ידי סיכום אזור האוטם של כל קטע (שטח של ההמיספרה הימנית פחות אזור לא נפגע של ההמיספרה השמאלית) באמצעות תוכנת תמונה J (https://imagej.net/software/imagej/index)18. חשב את אחוז נפח האוטם כנפח/נפח אוטם של ההמיספרה הימנית × 100%.</li>
</ol>7. ניתוח צביעה היסטופתולוגי ואימונופלואורסצנטי
<ol><li>קח את דגימות המוח מתמיסת paraformaldehyde ולשטוף אותם עם מים זורמים במשך 1 שעות.</li>
	<li>העבירו את דגימות המוח למכונת אוטומציה-רקמות-מייבשות. הפעל את התוכנית המוגדרת מראש להתייבשות, ויטריפיקציה וטבילת שעווה. הטמיעו את דגימות המוח המיובשות בפרפין וחתכו אותן למקטעים בעובי 5 מיקרומטר על ידי מיקרוטום.</li>
	<li>צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)<ol><li>מחלקים את החלקים עם קסילן 3 פעמים למשך 8 דקות כל אחד.</li>
		<li>הרטיבו את החלקים על ידי טבילה רצופה באתנול הדרגתי (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ומים מזוקקים למשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות.</li>
		<li>שטפו את החלקים במים מזוקקים כדי לשטוף את שאריות המטוקסילין, ולאחר מכן טבלו אותם באלכוהול חומצה הידרוכלורית 5% להבחנה של 5 שניות. שטפו את החלקים במים מזוקקים במשך 2 דקות.</li>
		<li>הכתימו את המקטעים בתמיסת אאוזין למשך 30 שניות ושטפו את עודפי נוזל הכתמים במים מזוקקים.</li>
		<li>לטבול את החלקים ב-90% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול וקסילן (2 פעמים) ברציפות במשך 5 דקות בכל פעם. הר את החלקים עם אמצעי הרכבה בלסם ניטרלי.</li>
	</ol></li>
	<li>צביעה אימונופלואורסצנטית<ol><li>טווקס את החלקים עם קסילן 3 פעמים במשך 8 דקות בכל פעם.</li>
		<li>יש לייבש מחדש את המקטעים על ידי טבילה רצופה באתנול הדרגתי (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ומים מזוקקים למשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>מחממים את תמיסת שליפת האנטיגן ציטראט לרתיחה במיקרוגל. לטבול את החלקים בתמיסת אחזור האנטיגן. חממו מחדש את מאגר אחזור האנטיגן בהספק נמוך (20 ואט) למשך 20 דקות.</li>
		<li>כבו את המיקרוגל ותנו למאגר שליפת האנטיגן להתקרר לטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>שטפו את המקטעים שלוש פעמים במי מלח חוצצים פוספט 0.1 מ"מ (PBS) במשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>דגרו על החלקים עם תמיסה חוסמת (אלבומין בסרום בקר 5%) ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום את הקישור הלא ספציפי של אימונוגלובולין.</li>
		<li>לדגור על החלקים עם נוגדן ארנב נגד NeuN (1: 300), נוגדן ארנב נגד Iba-1 (1: 500) ונוגדן עכבר נגד GFAP (1: 500) ב 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה.</li>
		<li>שטפו את המקטעים שלוש פעמים עם PBS של 0.1 mM במשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>דגרו על המקטעים עם IgG מצומד נגד ארנב עז Alexa 594 (1:500) או IgG מצומד נגד עכבר Alexa 488 (1:500) למשך שעה אחת ב-RT.</li>
		<li>שטפו את החלקים עם PBS של 0.1 mM והרכיבו אותם עם אמצעי הרכבה נגד דהייה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>צלם תמונות של שלושה שדות מיקרוסקופיים (300 מיקרומטר × 300 מיקרומטר) בתוך הפנומברה האיסכמית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 594 ננומטר ו 488 ננומטר, בהתאמה.</li>
		<li>באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), להעריך את צפיפות התאים המוכתמים באופן חיובי על ידי ממוצע ספירות בפנומברה איסכמית19.</li>
	</ol></li>
</ol>

חסימה של עורק אמצעי דיסטלי לפיתוח מודל עכבר שבץ איסכמי

<ol>
	<li>Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperacute+management+of+ischemic+strokes:+JACC+Focus+Seminar.">Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar.</a> J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).</li><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+stroke,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+study+2016.">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2019).</li><li>Joo, H., Wang, G., George, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+literature+review+of+cost-effectiveness+of+intravenous+recombinant+tissue+plasminogen+activator+for+treating+acute+ischemic+stroke.">A literature review of cost-effectiveness of intravenous recombinant tissue plasminogen activator for treating acute ischemic stroke.</a> Stroke Vasc Neurol. 2 (2), 73-83 (2017).</li><li>Jones, A. T., O'Connell, N. K., David, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+functional+stroke+mimic+patients:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Epidemiology of functional stroke mimic patients: a systematic review and meta-analysis.</a> Eur J Neurol. 27 (1), 18-26 (2020).</li><li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).</li><li>Kuraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+experimental+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+artery+induces+high+reproducibility+of+brain+ischemia+in+mice.">Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice.</a> Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Candelario-Jalil, E., Paul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+and+comorbidities+on+ischemic+stroke+outcomes+in+preclinical+animal+models:+A+translational+perspective.">Impact of aging and comorbidities on ischemic stroke outcomes in preclinical animal models: A translational perspective.</a> J Exp Neurol. 335, 113494 (2021).</li><li>Zuo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+secondary+damage+and+A&#946;+deposits+in+the+ipsilateral+thalamus+of+dMCAO+rats+through+reduction+of+cathepsin+B+by+bis(propyl)-cognitin,+a+multifunctional+dimer.">Attenuation of secondary damage and A&#946; deposits in the ipsilateral thalamus of dMCAO rats through reduction of cathepsin B by bis(propyl)-cognitin, a multifunctional dimer.</a> Neuropharmacology. 162, 107786 (2020).</li><li>Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., Mehrad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+histological,+and+behavioral+pathological+alterations+associated+with+the+mouse+model+of+photothrombotic+ischemic+stroke.">Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke.</a> J Chem Neuroanat. 130, 102261 (2023).</li><li>Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehabilitation+and+plasticity+following+stroke:+Insights+from+rodent+models.">Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models.</a> Neuroscience. 311, 180-194 (2015).</li><li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+stroke+in+mice:+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery.">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> J Vis Exp. (89), e51729 (2014).</li><li>Lavayen, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+the+cannabidiol+aminoquinone+VCE-004.8+in+experimental+ischemic+stroke+in+mice.">Neuroprotection by the cannabidiol aminoquinone VCE-004.8 in experimental ischemic stroke in mice.</a> Neurochem Int. 165, 105508 (2023).</li><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+B+knockout+confers+significant+brain+protection+in+the+mouse+model+of+stroke.">Cathepsin B knockout confers significant brain protection in the mouse model of stroke.</a> J Exp Neurol. 368, 114499 (2023).</li><li>Yu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemogenetic+stimulation+of+transplanted+iPS-NPCs+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke.">Optochemogenetic stimulation of transplanted iPS-NPCs enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> J Neurosci. 39 (33), 6571-6594 (2019).</li><li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+a+new+time+window+for+treatment+of+stroke+by+targeting+HDAC2.">Opening a new time window for treatment of stroke by targeting HDAC2.</a> J Neurosci. 37 (28), 6712-6728 (2017).</li><li>Shi, X. F., Ai, H., Lu, W., Cai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAT:+Free+software+for+the+semi-automated+analysis+of+rodent+brain+sections+with+2,3,5-triphenyltetrazolium+chloride+staining.">SAT: Free software for the semi-automated analysis of rodent brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining.</a> Front Neurosci. 13, 102 (2019).</li><li>Jensen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anat Rec. 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Donahue, J., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+CT+and+acute+stroke+imaging:+foundations,+applications,+and+literature+review.">Perfusion CT and acute stroke imaging: foundations, applications, and literature review.</a> J Neuroradiol. 42 (1), 21-29 (2015).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+L-3-n-butylphthalide+pretreatment+attenuates+ischemic+brain+injury+in+mice+with+permanent+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+through+the+Nrf2+pathway.">Long-term L-3-n-butylphthalide pretreatment attenuates ischemic brain injury in mice with permanent distal middle cerebral artery occlusion through the Nrf2 pathway.</a> Heliyon. 8 (7), e09909 (2022).</li><li>Balkaya, M. G., Trueman, R. C., Boltze, J., Corbett, D., Jolkkonen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+outcome+measures+to+improve+experimental+stroke+research.">Behavioral outcome measures to improve experimental stroke research.</a> Behav Brain Res. 352, 161-171 (2018).</li><li>Hao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanism+of+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+with+treatment+of+stepharine+in+rats.">Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats.</a> Phytomedicine. 79, 153353 (2020).</li><li>Pietrogrande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+post+conditioning+prevents+thalamic+secondary+neuronal+loss+caused+by+excitotoxicity+after+cortical+stroke.">Low oxygen post conditioning prevents thalamic secondary neuronal loss caused by excitotoxicity after cortical stroke.</a> Sci Rep. 9 (1), 4841 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+subtype-dependent+synapse+elimination+by+reactive+gliosis+in+mice.">Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice.</a> Nat Commun. 12 (1), 6943 (2021).</li><li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+modulates+stroke-induced+astrogliosis+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+brain.">Aryl hydrocarbon receptor modulates stroke-induced astrogliosis and neurogenesis in the adult mouse brain.</a> JNeuroinflammation. 16 (1), 187 (2019).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי של מודל dMCAO electrocoagulation craniotomy, ההליכים הכירורגיים מבוצעים עם פולשניות מינימלית, שבה רק חלק מהשריר הטמפורליס מופרד כדי למתן את ההשפעות השליליות על תפקוד המסטיקציה. כל העכברים התאוששו היטב לאחר ההליך, ללא מקרים נצפים של קשיי האכלה. ניתן להבחין בקלות ב-MCA בעצם הרקתית של העכבר, ו...

שבץ מוחי הוא מחלה מוחית חריפה נפוצה המאופיינת בשכיחות גבוהה של נכות ותמותה1. מתוך כלל מקרי השבץ, כמעט 80% שייכים לשבץ איסכמי2. עד כה, פקקת תוך ורידית נותרה אחת ממספר מצומצם של גישות פרודוקטיביות לטיפול בשבץ איסכמי חריף. עם זאת, האפקטיביות של טיפול thrombolytic מוגבל על ידי חלון הזמן האפקטיבי הצר ואת התרחשות של טרנספורמציה hemorrhagic3. בשלב השיקום ארוך הטווח לאחר שבץ איסכמי, מספר לא מבוטל של חולים צפויים לחוות הפרעות נוירולוגיות עמידות4. חקירה נוספת נדרשת בדחיפות כדי לפענח את המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של שבץ איסכמי, כמו גם להקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות הממוקדות שבץ איסכמי. הקמתו של מודל מהימן וניתן לשכפול של שבץ איסכמי היא חיונית למחקר בסיסי, כמו גם למחקר תרגומי מאוחר יותר בתחום השבץ האיסכמי.
בשנת 1981, Tamura et al. פיתחו מודל איסכמיה מוחית מוקדית על ידי שימוש באלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית באתר הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA)5. מאז, חוקרים רבים השתמשו במתודולוגיות שונות כגון קשירה, דחיסה או חיתוך כדי לגרום לחסימת MCA דיסטלית (dMCAO) לקביעת מודלים חולפים או קבועים של שבץ איסכמי 6,7,8. בהשוואה למודל חוט הלהט, מודל dMCAO מציג יתרונות בולטים כגון גודל אוטם קטן יותר ושיעור הישרדות גבוה יותר, מה שהופך אותו מתאים יותר לחקר התאוששות תפקודית ארוכת טווח לאחר שבץ איסכמי9. בנוסף, מודל dMCAO מדגים שיעור הישרדות גבוה יותר במכרסמים מזדקנים בהשוואה למודל חוט הלהט, מה שהופך אותו לכלי יתרון לחקר שבץ איסכמי במודלים של קשישים ובעלי חיים נלווים10. מודל שבץ פוטוטרומבוטי (PT) הוכח כבעל מאפיינים של פחות פולשניות כירורגית ושיעור תמותה נמוך משמעותית. עם זאת, מודל PT מציג רמה גבוהה יותר של נמק תאי ובצקת רקמות בהשוואה למודל dMCAO, מה שמוביל להיעדר מחזור בטחונות11. יתר על כן, ראוי לציין כי הנגעים האיסכמיים שנצפו במודל PT נובעים בעיקר מחסימת כלי דם, השונה באופן מהותי מהאיסכמיה המוחית הנגרמת על ידי תסחיף כלי דם גדולים במודל dMCAO12.
במאמר זה, אנו מציגים את המתודולוגיה להשראת מודל dMCAO מורין על ידי קרישת MCA דיסטלי באמצעות קרניוטומיה של חלון עצם קטן. בנוסף, ערכנו בדיקות היסטולוגיות והערכות התנהגותיות כדי לאפיין באופן מקיף את תוצאות העלבונות והשבץ האיסכמי במודל ניסויי זה. אנו שואפים להכיר לחוקרים מודל זה ולהקל על חקירות נוספות של המנגנונים הפתולוגיים של שבץ איסכמי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium 
			Chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108380</td>
			<td>Dye for TTC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning (USA)</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Vessel for TTC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% bovine serum albumin</td>
			<td>Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.</td>
			<td>AR004</td>
			<td>Non-specific antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Polyglycolic acid suture</td>
			<td>Jinhuan Medical Co., Ltd</td>
			<td>KCR531</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>Midmark Corporation</td>
			<td>VMR</td>
			<td>Anesthetized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotech</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Seal for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automation-tissue-dehydrating&#160; 
			machine</td>
			<td>Leica Biosystems (Germany)</td>
			<td>TP1020</td>
			<td>Dehydrate tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Veet (France)</td>
			<td>20220328</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diclofenac&#160;sodium&#160;gel</td>
			<td>Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical 
			&#160;Co., Ltd.</td>
			<td>H10950214</td>
			<td>Analgesia for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill tip (0.8 mm)</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining solution</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1001</td>
			<td>Dye for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>H44023098</td>
			<td>Material for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus (Japan)</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP Mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>3670</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 
			488-conjugated IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>4408</td>
			<td>Second antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 
			594-conjugated IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>8889</td>
			<td>Second antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grip strength meter</td>
			<td>Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.</td>
			<td>XR501</td>
			<td>Equipment for behavioral test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin staining solution</td>
			<td>Wuhan Servicebio Technology 
			Co., Ltd.</td>
			<td>G1004</td>
			<td>Dye for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 Rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178846</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td>Anesthetized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser doppler blood flow meter</td>
			<td>Moor Instruments (UK)</td>
			<td>moorVMS</td>
			<td>Blood flow monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer-Ingelheim</td>
			<td>J20160020</td>
			<td>Analgesia for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdrill</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>78001</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical instruments set</td>
			<td>Rwd Life Science Co., Ltd.</td>
			<td>SP0009-R</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td>HM325</td>
			<td>Tissue section production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Leica Biosystems (Germany)</td>
			<td>819</td>
			<td>Tissue section production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopolar electrocoagulation generator</td>
			<td>Spring Scenery Medical Instrument 
			Co., Ltd.</td>
			<td>CZ0001</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin ointment</td>
			<td>Tianjin Smith Kline &#38; French 
			Laboratories Ltd.</td>
			<td>H10930064</td>
			<td>Anti-infection for animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN Rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology Inc. 
			(Danvers, MA, USA)</td>
			<td>24307</td>
			<td>Primary antibody for IF staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Absin Bioscience</td>
			<td>abs9177</td>
			<td>Seal for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding center</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Produce paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>Euthanized animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Rinsing for tissue section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Shenzhen Codos Electrical Appliances 
			Co.,Ltd.</td>
			<td>CP-9200</td>
			<td>Equipment for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate solution</td>
			<td>Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>P0083</td>
			<td>Antigen retrieval for IF staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of acute ischemic stroke in mice using the distal middle artery occlusion technique

שבץ איסכמי נותר הגורם העיקרי לתמותה ולפגיעה תפקודית בקרב האוכלוסיות הבוגרות בעולם. רק מיעוט מחולי שבץ איסכמי זכאים לקבל טרומבוליזה תוך וסקולרית או טיפול תרומבקטומיה מכנית בחלון הזמן האופטימלי. בקרב אותם מחלימים משבץ מוחי, כשני שלישים סובלים מהפרעות נוירולוגיות לאורך תקופה ממושכת. ביסוס מודל שבץ איסכמי ניסיוני יציב וניתן לחזרה הוא משמעותי ביותר להמשך חקירת המנגנונים הפתופיזיולוגיים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות לשבץ איסכמי. עורק המוח האמצעי (MCA) מייצג את המיקום הדומיננטי של שבץ איסכמי בבני אדם, כאשר חסימת MCA משמשת כמודל הנפוץ של איסכמיה מוחית מוקדית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את המתודולוגיה של הקמת מודל חסימת MCA דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6. מכיוון שאתר החסימה ממוקם בענף קליפת המוח של MCA, מודל זה מייצר נגע אוטם בינוני המוגבל לקליפת המוח. אפיון נוירולוגי התנהגותי והיסטופתולוגי הדגים תפקוד מוטורי נראה לעין, ניוון נוירונים והפעלה בולטת של מיקרוגליה ואסטרוציטים במודל זה. לפיכך, מודל עכבר dMCAO זה מספק כלי רב ערך לחקר איסכמיה וערך של פופולריזציה.

Stroke is a common acute cerebrovascular disease characterized by high incidences of disability and fatality1. Of all stroke cases, nearly 80% belong to ischemic stroke2. Up to now, intravenous thrombolysis remains one of a limited number of productive approaches for the treatment of acute ischemic stroke. However, the effectiveness of thrombolytic treatment is restricted by the narrow effective time window and the occurrence of hemorrhagic transformation3. In the long-term rehabilitation phase following an ischemic stroke, a considerable number of patients are likely to experience durable neurological dysfunctions4. Further investigation is urgently required to unravel the underlying pathophysiological mechanisms of ischemic stroke, as well as to facilitate the development of novel therapeutic strategies targeting ischemic stroke. The establishment of a dependable and replicable model of ischemic stroke is crucial for basic research as well as subsequent translational research in the field of ischemic stroke.
In 1981, Tamura et al. developed a focal cerebral ischemia model by employing transcranial electrocoagulation at the proximal site of the middle cerebral artery (MCA)5. Since then, numerous researchers have utilized various methodologies such as ligation, compression, or clipping to induce distal MCA occlusion (dMCAO) for establishing transient or permanent ischemic stroke models6,7,8. Compared to the filament model, the dMCAO model exhibits notable advantages such as smaller infarct size and higher survival rate, rendering it more suitable for investigating long-term functional recovery subsequent to ischemic stroke9. In addition, the dMCAO model demonstrates a higher survival rate in aged rodents compared to the filament model, making it an advantageous tool for investigating ischemic stroke in elderly and comorbid animal models10. The photothrombotic (PT) stroke model has been demonstrated to possess the characteristics of less surgical invasiveness and a significantly low mortality rate. However, the PT model exhibits a greater degree of cellular necrosis and tissue edema compared to the dMCAO model, leading to the absence of collateral circulation11. Furthermore, it is noteworthy that the ischemic lesions observed in the PT model predominantly arise from microvascular occlusion, which differs substantially from the cerebral ischemia induced by large vessel embolism in the dMCAO model12.
In this paper, we present the methodology for inducing the murine dMCAO model by coagulating the distal MCA via small bone window craniotomy. Additionally, we conducted histological examinations and behavioral evaluations to comprehensively characterize the ischemic insults and stroke outcomes in this experimental model. We aim to acquaint researchers with this model and facilitate further investigations into the pathologic mechanisms of ischemic stroke.

זרקור על המחבר: ביסוס מודל חסימה דיסטלי אמין של MCA בעכברים לחקר שבץ מוחי

השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

In the present research, we aim to provide a comprehensive and detailed protocol for establish middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6J mice using transcranial electrocoagulation and we evaluated the subsequent neurological behavior and histopathological features. The middle cerebral artery or MCA is recognized as the primary site of ischemic stroke in humans. The MCA occlusion methods, including technique, photochemical introduction, and occlusion have been extensively employed to induce focal cerebral ischemia in rodents.Compared to other ischemia stroke models, this model has the advantage of less surgical invasiveness, smaller infarct size, and higher survival rate, rendering it more suitable for investigation the long-term functional recovery after ischemic stroke. Overall, the current approach effectively generates a reliable experimental ischemic stroke model that exhibits high survivability and excellent repeatability. Consequently, this methodology serves as an invaluable tool for both foundation and translational research in the field of stroke.In the future, we will employ behavior paradigms such as novel object recognition and water maze to investigate the dynamic alterations in long-term learning and memory capabilities among distal MCA-occluded mice. This will enable us to ascertain the viability of utilizing them as animal model for cognition-impairment studies post-stroke.

המכשירים העיקריים שמשמשים לביצוע dMCAO הם סט המכשירים המיקרו-כירורגיים, מכשיר האידוי איזופלורן ומחולל הקרישה המיקרו-כירורגי המונופולרי שמוצג באיור 1. ההליך הניסויי של המחקר הזה מומחש באיור 2. בקצרה, נעשה שימוש בקרניוטומיה קטנה של חלון עצם כדי לחשוף את ה- MCA הד...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic ...

במחקר הנוכחי, אנו שואפים לספק פרוטוקול מקיף ומפורט לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי בעכברי C57BL/6J באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית, והערכנו את ההתנהגות הנוירולוגית והמאפיינים ההיסטופתולוגיים הבאים. עורק המוח האמצעי או MCA מוכר כאתר העיקרי של שבץ איסכמי בבני אדם. שיטות החסימה של MCA, כולל טכניקה, החדרה פוטוכימית וחסימה שימשו באופן נרחב כדי לגרום לאיסכמיה מוחית מוקדית במכרסמים.בהשוואה למודלים אחרים של שבץ איסכמיה, למודל זה יש יתרון של פחות פולשניות כירורגית, גודל אוטם קטן יותר ושיעור הישרדות גבוה יותר, מה שהופך אותו מתאים יותר לחקירת ההתאוששות התפקודית ארוכת הטווח לאחר שבץ איסכמי. בסך הכל, הגישה הנוכחית מייצרת למעשה מודל שבץ איסכמי ניסיוני אמין המציג שרידות גבוהה וחזרתיות מצוינת. כתוצאה מכך, מתודולוגיה זו משמשת כלי רב ערך הן למחקר יסוד והן למחקר תרגומי בתחום השבץ.בעתיד, נשתמש בפרדיגמות התנהגות כגון זיהוי עצמים חדשניים ומבוך מים כדי לחקור את השינויים הדינמיים ביכולות למידה וזיכרון ארוכות טווח בקרב עכברים דיסטליים המוסתרים על ידי MCA. זה יאפשר לנו לוודא את הכדאיות של השימוש בהם כמודל חייתי למחקרים על ליקויי קוגניציה לאחר שבץ.

induction-acute-ischemic-stroke-mice-using-distal-middle-artery

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique

1.2K Views.  Jianghan University. במחקר הנוכחי, אנו שואפים לספק פרוטוקול מקיף ומפורט לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי בעכברי C57BL/6J באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית, והערכנו את ההתנהגות הנוירולוגית והמאפיינים ההיסטופתולוגיים הבאים. עורק המוח האמצעי או MCA מוכר כאתר העיקרי של שבץ איסכמי בבני אדם. שיטו...

Video: זרקור על המחבר: ביסוס מודל חסימה דיסטלי אמין של MCA בעכברים לחקר שבץ מוחי

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic stroke patients are eligible to receive intravascular thrombolysis or mechanical thrombectomy therapy within the optimal time window. Among those stroke survivors, around two-thirds suffer neurological dysfunctions over an extended period. Establishing a stable and repeatable experimental ischemic stroke model is extremely significant for further investigating the pathophysiological mechanisms and developing effective therapeutic strategies for ischemic stroke. The middle cerebral artery (MCA) represents the predominant location of ischemic stroke in humans, with the MCA occlusion serving as the frequently employed model of focal cerebral ischemia. In this protocol, we describe the methodology of establishing the distal MCA occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6 mice. Since the occlusion site is located at the cortical branch of MCA, this model generates a moderate infarcted lesion restricted to the cortex. Neurological behavioral and histopathological characterization have demonstrated visible motor dysfunction, neuron degeneration, and pronounced activation of microglia and astrocytes in this model. Thus, this dMCAO mouse model provides a valuable tool for investigating the ischemiastroke and worth of popularization.

Here, we present a protocol to establish a distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6J mice and evaluate the subsequent neurological behavior and histopathological features.

Distal Middle Artery Occlusion Procedure to Induce Ischemic Stroke in Mice

To begin, wipe the heating surgery board with 75%ethanol and set the temperature to 37 degrees Celsius. Place the anesthetized mouse in a right lateral position on the board with the head positioned away. To protect the cornea from drying, apply eye ointment.After shaving the fur from the left orbit to the left ear canal, use a depilatory cream to remove the remaining fur. Disinfect the surgical area three times with povidone iodine and 75%ethanol. Perform a toe-pinch assessment.After making a vertical incision between the left orbit and the left ear canal, retract the soft skin tissue to expose the temporal muscle. Using straight micro forceps, separate the apical and dorsal segments of the temporal muscle from the skull. Identify the Y-shaped bifurcation of the middle cerebral artery, or MCA, beneath the temporal bone.Then using an electric cranial drill, thin out the skull to make a bone window until the dura mater becomes visible. Remove the dura mater above the MCA with curved micro forceps. Using electric coagulation forceps, coagulate the artery at the site's proximal and distal to the bifurcation.Monitor the blood flow of the left MCA cortical branch in a laser speckle blood-flow meter. Then suture the muscle and the skin separately with polyglycolic acid sutures, and apply diclofenac sodium gel and mupirocin ointment to the skin incision. Place the mouse in a recovery chamber.

הליך חסימת עורק אמצעי דיסטלי לגרימת שבץ איסכמי בעכברים

Neurological Behavioral Tests in Distal Middle Artery Occluded Mice to Study Ischemic Stroke Outcomes

To perform the grip strength test in the previously developed distal MCAO model, grasp the posterior section of a mouse tail and gradually lower the mouse until it holds the horizontal bar with both forepaws. Keeping the body horizontal, pull the mouse backward at a constant speed of two centimeters per second. When the mouse releases its forepaws from the bar, record the peak force in grams.For the pole test, place the mouse vertically on the top of a wooden pole. Record the time taken by the mouse to turn around and the total time to climb down the pole with a 60-second cutoff time. To conduct the adhesive test, attach a patch of adhesive tape to the right forepaw of the mouse.Put the mouse back into the rearing cage and record the time taken by the mouse to remove the adhesive with a 60-second cutoff time. To conduct a cylinder test, wipe an open top clear glass cylinder with 75%ethanol, and place the mouse in it. Using a camera, record its spontaneous standing exploratory behavior for three minutes.The distal MCAO mice showed a significant reduction in grip strength and contralateral forepaw usage rate as compared to the sham operated group. Further, the occluded mice showed a significant increase in the descent time in the pole test, and in the time taken to remove the adhesive.

בדיקות נוירולוגיות התנהגותיות בעכברים חסומים בעורק האמצעי הדיסטלי כדי לחקור תוצאות שבץ איסכמי

Mouse Brain Histology to Study the Pathological Mechanisms of Ischemic Stroke Induced by Distal Middle Artery Occlusion

To begin, obtain the dissected brain of the euthanized distal MCAO mouse model after behavioral testing, and place it in a minus 20 degrees Celsius freezer for 20 minutes. Then position the brain into a one-millimeter brain matrix. And using microtone blades, slice the brain into two-millimeter-thick coronary sections.Transfer the brain sections to a 24-well culture plate and add 2%TTC to cover the brain tissue. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then carefully fix the brain section in 4%Paraldehyde solution for 15 minutes.Using a scanister, perform optical scanning of the brain sections. The histological analysis of the brain revealed the disordered arrangement of neuron cells and a significant reduction in the density of NeuN positive cells in the peri-infarct area of the distal MCA occluded mice.