הפיתוח הראשוני של מערכת התרבות המאווררת בנפח נמוך נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (CRI-OA-1416690 למכללת דיקינסון). ד"ר לורן מולינו סיפקה באדיבות מתקני מעבדה במכון האוקיינוגרפי וודס הול, שם נאספו הנתונים שהוצגו עבור מערכת זו (איור 4).

1. תמרונים שגרתיים להקמה ותחזוקה של תרביות זחלים של C. fornicata
הערה: שיטה זו מתחילה עם צנצנת גלון (3.8 ליטר) של מי ים המכילה C. fornicata בוגרים שזה עתה שחררו זחלי וליגר מגודלים. ניתן לאסוף מבוגרים בשטח או להשיגם מספק המופיע בטבלת החומרים. הבוגרים הם הרמפרודיטים פרוטנדרוסים החיים בערימות הזדווגות עם נקבות ססיליות בתחתית הערימה. אין לפרק ערימות למבוגרים. עונתיות הרבייה ושיטות להתניה של בוגרים להשרצה מחוץ לעונה תוארו בעבר17. הזחלים נאספים בצורה הטובה ביותר תוך 2-3 שעות לאחר שחרורם, כאשר הם גיאושליליים מאוד ויתרכזו ליד פני השטח של הצנצנת.
<ol><li>צור מסננת על ידי חיתוך החלק התחתון של פלסטיק חד פעמית תלת פינתית בנפח 400 מ"ל והדבקה על לוח של רשת ניילון בגודל 236 מיקרומטר. למטרה זו ובמיוחד לבניית מזוקוסמוס (להלן), השתמשו בדבק מומס חם המיוצר להדבקה טובה לפוליאתילן.</li>
	<li>הסר אוורור מהצנצנת הבוגרת ותן לה לעמוד במשך 15-20 דקות, כך שהפסולת תשקע והזחלים יוכלו לשחות בקלות אל פני השטח.</li>
	<li>סיפון הזחלים באורך קצר (15-20 ס"מ) של צינורות זכוכית בקוטר 5 מ"מ המודבקים לקצה צינור אקווריום פלסטיק רך באורך 60-80 ס"מ לתוך המסננת שהוכנה כנ"ל, תלויים בתוך זכוכית בנפח 600 מ"ל כך שעודפי מי ים עולים על גדותיהם של הזכוכית בעוד הזחלים נשמרים על המסננת. שמרו על תחתית המסננת מתחת למים והימנעו מזחלים תקועים.</li>
	<li>הרימו לרגע את המסננת מהכוס והשתמשו בבקבוק התזת מי ים מסוננים (FSW) כדי לשטוף את הזחלים לתוך קערת זכוכית של FSW בגודל נוח למניפולציה תחת מיקרוסקופ ניתוח בהספק נמוך. הערה: זחלים של C. fornicata משגשגים במי ים טבעיים מסוננים ליד מליחות 30 ppt או במי ים מלאכותיים Instant Ocean העשויים עד 32 ppt. מליחות, ב 20-25 ° C17,18. סינון ב < 1 מיקרומטר מספיק כדי לחסל פרוטיסטים אפיזוטיים עכורים שיכולים לגרום לבעיות בתרביות מעבדה.</li>
	<li>מעבירים ידנית וסופרים את מספר הזחלים הרצוי לצנצנת תרבית באמצעות פיפט פסטר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בנפח תרבית של זחל אחד/5 מ"ל עבור C. fornicata. ספרו את הזחלים והימנעו מהפיתוי להעריך מספרים.</li>
	<li>האכילו את הזחלים במנה הרצויה של מיקרו-אצות כאשר התרבית מתחילה ופעם ביומיים החליפו את המיקרו-אצות כאשר מוחלפים מי תרבית. הערה: דיאטה של 1 x 105 תאים / מ"ל איזוכריזיס גלבנה (זן T-ISO) היא תזונה סטנדרטית טובה המניבה שיעורי צמיחה כמעט מקסימליים במעבדה. הקצבת מזון ושיטות לתרבות של T-ISO מסופקים בפרסום מוקדם יותר17.</li>
	<li>החליפו את מי התרבית אחת ליומיים על ידי מזיגת תכולת התרבית לתוך מסננת בתוך כוסית, כמו בשלב 1.3 לעיל. הרימו את המסננת והשתמשו בבקבוק שפריץ של FSW כדי לשטוף זחלים לתוך צנצנת תרבית של FSW טרי עם מזון חדש. הערה: השיטה הטובה ביותר היא להפריד כל כלי זכוכית המשמשים לתרבית זחלים ולהימנע מכל מגע של כלי זכוכית אלה עם קיבוע, מלחי מתכת כבדים מסיסים או דטרגנטים. ניקוי שגרתי נעשה בצורה הטובה ביותר עם משחה של סודה לשתייה (NaHCO3) וכרית קרצוף ניילון, בעוד מרבצי מינרלים ניתן להסיר עם שטיפת חומצה עדינה בחומץ לבן או לדלל HCl.</li>
</ol>2. בניית תרביות מאווררות לזחלים של C. fornicata
הערה: לצנצנת הזכוכית המומלצת (טבלת חומרים) יש מכסה פוליפרופילן, שהוא אינרטי למי ים ובעל העובי הנכון להידוק פתחי צינורות לזרם גז מאוורר.
<ol><li>קודחים שני חורים בקוטר 5 מ"מ במכסה של כל צנצנת תרבית (כולל התוחם הפנימי של המכסה), כל אחד מהם במרחק של כ-1.5 ס"מ מהקצה וממול לשני. (מקדח קיסרי בגודל 13/64 אינץ 'או #7 ASME סטנדרטי של מכונאי יעשה גם חור אישור מתאים).</li>
	<li>התקן מתאם צינורות ניילון מושחל בגודל 1/8 אינץ 'x 10-32 בכל חור, באמצעות אום ניילון 10-32, עם מוט הצינור על פני השטח החיצוניים של המכסה.</li>
	<li>מרחו חומר איטום של אקווריום גומי סיליקון על הצמצם של החלק הפנימי המושחל של אחד ממתאמי הצינור ודחפו צינור פוליאתילן באורך 20 ס"מ של 2 מ"מ (קוטר חיצוני) דרך הצמצם מבפנים כך שהוא יבלוט כמה מ"מ מעבר לצמצם החיצוני של מוט הצינור.</li>
	<li>לצינורות יהיה כעת תקע קטן של חומר איטום אקווריום בקצה הבולט דרך מוט הצינורות, אך צינורות שקופים ייראו ממש מעבר לקצה הברב. תן את חומר האיטום לרפא, ולאחר מכן לקצץ את הקצה הבולט של צינור פוליאתילן כך שהוא סומק עם קצה צינור.</li>
	<li>מלאו את צנצנת התרבית ב-FSW עד למרחק של 1 ס"מ מהכתף בחלק העליון של הצנצנת, הבריגו את המכסה וחברו את האוויר המאוורר או את תערובת הגז הניסיונית לצינור המחזיק את צינור אוורור הפוליאתילן. חתכו את אורך צינור האוורור כך שקצהו מונח בצורה מסודרת בתחתית הצנצנת.</li>
	<li>התאימו את זרימת האוויר המאוורר או תערובת הגז כדי ליצור זרם איטי של בועות (איור 1). השתמש במשאבת אוויר לאקווריום עם שסתומי כנופיות אקווריום משותפים כדי לספק אוורור עם אוויר הסביבה או השתמש בבקרי זרימה המונית עבור תערובות גז אטמוספרי ניסיוניות אחרות14.</li>
</ol>3. בניית תרבית מזוקוסמוס הניתנת לפריסה בשדה עבור זחלים של C. fornicata
<ol><li>חותכים 4 פתחים מלבניים במרווחים שווים, כל אחד בגודל 25 ס"מ x 14.5 ס"מ, בצידי דלי פוליאתילן סטנדרטי של 7 גלון. מקמו את החלק התחתון של כל פתח במרחק של כ-3.5 ס"מ מהתחתית הפנימית של הדלי (איור 2A). מסור חרב חשמלי ידני עם להב בעל שיניים עדינות אידיאלי למטרה זו. שומרים את חתיכות הפסולת החתוכות ופורסים אותן לאורכן לרצועות ברוחב 2 ס"מ בעזרת מסור שולחן.</li>
	<li>גזרו 4 לוחות של רשת ניילון בגודל 236 מיקרומטר, כל אחד בגודל 30X20 ס"מ לפחות, כדי לחפוף בנוחות (ב-2 ס"מ לפחות) את פתחי החיתוך בדלי. אבטחו באופן זמני קצה אחד של לוח רשת שינוי על קצה ארוך של המגרעת בעזרת מהדקים קפיציים קטנים או סיכות כביסה.</li>
	<li>הדביקו את קצה לוח הרשת לפתח הדלי בדבק מומס חם המיוצר עבור פוליאתילן. לאחר הידוק הקצה הראשון, הדביקו את הקצוות האחרים תוך שמירה על מתח לקבלת משטח מתוח בלוח הרשת.</li>
	<li>חתוך את אורכן של רצועות פסולת הדלי משלב 3.1, כדי ליצור רצועות חיזוק שיכסו בצורה מסודרת את האזור המודבק שבו לוחות הרשת חופפים את פתחי הדלי. לחץ על כל רצועת כיסוי במקומה עם כמות נדיבה של דבק נמס חם, ועבוד במהירות כדי לקבל כל רצועה במקומה לפני שהדבק מתקשה.</li>
	<li>אבטחו את הקצה של כל רצועה באמצעות מסמר תריס ניילון המותקן מבחוץ של הדלי. חותכים עודפי דבק ורשת מהקצוות החיצוניים של רצועות החיזוק בעזרת סכין גילוח שימושית. הערה: כל מסמר דורש חור טייס בגודל 15/64 אינץ'. החלקים הפנימיים (העיוורים) של המסמרות נראים בחלק הפנימי של המזוקוסמוס המוגמר באיור 2B.</li>
	<li>פרסו את המזוקוסמוס במדף צף שמחזיק את החלק העליון של הדלי הרבה מעל המים (איור 2C). המדף הצף המוצג עשוי מקטעים של 30 ס"מ של צינור PVC 2 אינץ 'Schedule 40, צמנטי יחד עם מפרקי מרפקים וטי ליצירת מבנה אטום שיכול להחזיק שורה של 4 מזוקוסמות משוכפלות.</li>
	<li>בהתאם לתנאים המקומיים, לוחות הרשת עלולים להתקלקל תוך 1-2 ימים, באופן המעכב את חילופי מי הים דרך המזוקוסמוס. במידה שזה קורה, מעבירים את הזחלים למזוקוסמוס טרי ונקי על ידי משיכת המזוקוסמוס העכור 2/3rd מהמים וחילוץ חוזר ונשנה מקרקעיתו לתוך המזוקוסמוס הטרי עם קנקן 2 ליטר.</li>
	<li>בצע 20-25 חזרות כדי להעביר את רוב הזחלים, או עד שהזחלים כבר לא נצפים במזוקוסמוס העכור. נקו את המזוקוסמוס על ידי קרצוף עדין של לוחות הרשת בספוג רך עמוס במשחה של סודה לשתייה (NaHCO3) ושטפו במי ברז.</li>
</ol>

גידול זחלים של Crepidula fornicata בתנאי מעבדה ושדה

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryology+of+Crepidula:+a+contribution+to+the+cell+lineage+and+early+development+of+some+marine+gastropods.">The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods.</a> Gasteropods. , (1897).</li><li>Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Lyons, D. C., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slipper+snail+tales:+how+Crepidula+fornicata+and+Crepidula+atrasolea+became+model+molluscs.">Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs.</a> Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).</li><li>Blanchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata+(L.+1758)+in+Europe.+Current+state+and+consequences.">Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences.</a> ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).</li><li>Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+reproductive+dynamics+of+the+invasive+slipper+limpet,+Crepidula+fornicata.">Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+temperature,+growth+rate,+and+duration+of+planktonic+life+for+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).</li><li>Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+effects:+surprising+consequences+of+embryonic+and+larval+experience+on+life+after+metamorphosis.">Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis.</a> Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).</li><li>Pechenik, J. A., Gee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+metamorphic+competence+in+larvae+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.),+judged+by+a+natural+and+an+artificial+cue.">Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).</li><li>Taris, M., Comtet, T., Viard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+function+of+nitric+oxide+on+the+onset+of+metamorphosis+in+competent+larvae+of+Crepidula+fornicata:+A+transcriptional+perspective.">Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective.</a> Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).</li><li>Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+settlement+in+veliger+larvae+of+the+gastropod,+Crepidula+fornicata.">Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata.</a> Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).</li><li>Meyer-Kaiser, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carryover+effects+of+brooding+conditions+on+larvae+in+the+slipper+limpet+Crepidula+fornicata.">Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata.</a> Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).</li><li>Noisette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+encapsulation+protect+embryos+from+the+effects+of+ocean+acidification?+The+example+of+Crepidula+fornicata.">Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata.</a> PLoS One. 9 (3), e93021 (2014).</li><li>Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilience+of+Atlantic+slippersnail+Crepidula+fornicata+larvae+in+the+face+of+severe+coastal+acidification.">Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification.</a> Front in Mar Sci. 5, 312 (2018).</li><li>Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legacy+of+multiple+stressors:+Responses+of+gastropod+larvae+and+juveniles+to+ocean+acidification+and+nutrition.">Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition.</a> Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).</li><li>Pechenik, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ocean+acidification+on+growth,+onset+of+competence,+and+perception+of+cues+for+metamorphosis+in+larvae+of+the+slippershell+snail,+Crepidula+fornicata.">Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata.</a> Mar Biol. 166, 128 (2019).</li><li>Reyes, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marine+gastropod+Crepidula+fornicata+remains+resilient+to+ocean+acidification+across+two+life+history+stages.">The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages.</a> Front Physiol. 12, 702864 (2021).</li><li>Pires, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+seawater+culture+of+the+gastropod+Crepidula+fornicata+for+studies+of+larval+settlement+and+metamorphosis.+In:+Carroll,+D.,+Stricker,+S.+(eds)+Developmental+biology+of+the+sea+urchin+and+other+marine+invertebrates.">Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates.</a> Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).</li><li>Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interactive+influence+of+temperature+and+salinity+on+larval+and+juvenile+growth+in+the+gastropod+Crepidula+fornicata+(L.).">The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.).</a> J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).</li><li>Strathmann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , (1987).</li><li>Clark, H. R., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+fluctuations+in+CO2+and+dissolved+oxygen+concentrations+do+not+provide+a+refuge+from+hypoxia+and+acidification+for+early-life-stage+bivalves.">Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves.</a> Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114 (2016).</li><li>Gobler, C. J., Baumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+acidification+in+ocean+ecosystems:+coupled+dynamics+and+effects+on+marine+life.">Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life.</a> Biol Lett. 12 (5), 20150976 (2016).</li><li>Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+larval+and+juvenile+growth+rates+in+two+marine+gastropods,+Crepidula+plana+and+C.">Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C.</a> fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).</li><li>Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+food+on+metamorphic+competence+in+the+model+system+Crepidula+fornicata.">Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata.</a> Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).</li><li>Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coastal+ocean+acidification:+the+other+eutrophication+problem.">Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem.</a> Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).</li></ol>

אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.

למרות שזחלים של C. fornicata קלים יחסית לתרבית בהשוואה לזחלים ימיים פלנקטוטרופיים אחרים, תשומת לב ליסודות של פרקטיקת תרבות טובה עדיין חיונית17,19. זחלים בריאים צריכים להתחיל להאכיל מיד לאחר הבקיעה. ניתן לאמת זאת בקלות ביום שלאחר הבקיעה על ידי התבוננות במעיים ...

הצלע המחליקה, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), מיוצגת היטב בספרות המחקר העכשווית וההיסטורית בשל יעילותה כמודל התפתחותי ובשל השפעותיה הנרחבות כמין פולש. הוא שימש דוגמה יסודית להתפתחות ספירלית בעידן הקלאסי של אמבריולוגיה ניסיונית1 וחווה לידה מחודשת של עניין עם יישום של הדמיה מודרנית וכלים גנומיים לנתח מנגנונים של התפתחות מוקדמת lophotrochozoan 2,3. בקצה השני של תולדות חייו, חקירות אחרות התמקדו בהשפעות של אוכלוסיות בוגרות של מהנדס מערכות אקולוגיות זה בסביבות ימיות חופיות ממוזגות, רחוקות מאוד מתפוצתו המקורית במזרח צפון אמריקה 4,5. בין עובר לבוגר, זחלי הווליג'ר של מין זה היו מושא למחקרים רבים על התפתחות הזחל והאקולוגיה, במיוחד על גורמים המשפיעים על גדילה ורכישת כשירות למטמורפוזה, הרמזים הפנימיים והחיצוניים המתווכים את התיישבות הזחל, והשפעות חוויית הזחל על ביצועי הצעירים 6,7,8,9,10,11 . מחקרים אחרונים חשפו את עמידותם של זחלים וצעירים של C. fornicata להחמצת האוקיינוס, אפיק נוסף לשימוש מחקרי פרודוקטיבי בבעל חיים זה 12,13,14,15,16.
יתרון של C. fornicata למחקרים של ביולוגיה של זחלים ימיים הוא שקל יחסית לגדל במעבדה במי ים טבעיים או מלאכותיים על תזונה חד אצתית של השוטון Isochrysis galbana. שיטות התרבות פורטו על ידי המחבר בפרסום מודפס מוקדם יותר המתמקד בשיטות17. הסיבות לתרומה הנוכחית הן כפולות. ראשית, התמרונים הפיזיים השגרתיים הכרוכים בביסוס תרבויות ובטיפול בהן הם פשוטים מאוד מבחינה רעיונית אך קשים לביצוע נכון ללא התנסות מעשית או הדגמת וידאו. שנית, מתוארות שתי וריאציות על שיטות תרבית שתוארו קודם לכן, המתאימות במיוחד למחקרי מעבדה ושדה של תגובות לגורמי עקה סביבתיים כגון החמצת אוקיינוסים, אטרופיקציה ודלדול חמצן. הראשונה שבהן היא מערכת תרבית בנפח נמוך (800 מ"ל) המתאימה למניפולציה של pH וחמצן מומס במי ים באמצעות נפחים קטנים של גזים מבעבעים, והשנייה היא מערכת מזוקוסמוס בעלת נפח גדול יותר (15 ליטר) שניתן למקם בשדה ומאפשרת החלפה חופשית של מי ים סביבתיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bucket, Polyethylene, 7 gallon</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>16916</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crepidula fornicata</td>
			<td>Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center</td>
			<td>760</td>
			<td>adult broodstock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotmelt glue, Infinity Supertac 500</td>
			<td>Hotmelt.com</td>
			<td>INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB</td>
			<td>good for bonding polyethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lid</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-19316P-W</td>
			<td>for 800 mL ventilated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh, 236 &#181;m</td>
			<td>Dynamic Aqua Supply Ltd.</td>
			<td>NTX236-136</td>
			<td>for mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, hex, nylon, 10-32 thread</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>1004554441</td>
			<td>for fastening tubing barbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivets, nylon, blind, 15/64&#34; diameter, 5/32&#34;-5/16&#34; grip range, pack of 8</td>
			<td>NAPA auto parts</td>
			<td>BK 6652844</td>
			<td>4 packs needed per mesocosm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing barb 1/8&#34; x 10-32 thread</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65593</td>
			<td>2 needed per culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, polyethylene, 2.08 mm OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-170-11G</td>
			<td>for ventilating gas stream inside culture jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Tygon, 1/8&#34;x3/16&#34;x1/32&#34;</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>57810</td>
			<td>fits barbs for ventilating cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory and field culture of larvae of the slipper limpet, crepidula fornicata

רכיכת הגסטרופוד הקליפטראידית, Crepidula fornicata, נמצאת בשימוש נרחב במחקרים של ביולוגיה התפתחותית של הזחל, פיזיולוגיה ואקולוגיה. זחלי ויליגר ממין זה נאספו על ידי סיפון על מסננת לאחר שחרור טבעי על ידי בוגרים, הופצו לתרבית בצפיפות של 200/L, והוזנו באיזוכריזיס גלבנה (זן T-ISO) ב 1 x 105 תאים / מ"ל. גדילת קונכיות ורכישת כשירות למטמורפוזה תועדו עבור זחלים אחים שגודלו בתרביות מאווררות של 800 מ"ל שתוכננו לשיווי משקל לאוויר הסביבה או לתערובות גזים אטמוספריות מוגדרות. בניגוד לתנאי תרבית מעבדה אלה; נתוני גדילה וכשירות נאספו גם עבור זחלים שגודלו במזוקוסמה של מי ים בזרימה של 15 ליטר הממוקמת באוכלוסיית שדה של בוגרים רבייתיים. שיעורי הצמיחה והתזמון של יכולת מטמורפית בתרביות מעבדה היו דומים לאלה שדווחו במחקרים שפורסמו בעבר. הזחלים שגודלו בשדה מזוקוסמוס גדלו הרבה יותר מהר ועברו מטמורפוזה מוקדם יותר ממה שדווח בכל מחקרי המעבדה. יחד, שיטות אלה מתאימות לחקר התפתחות הזחלים בתנאים מבוקרים שנקבעו מראש במעבדה וכן בתנאים טבעיים בשטח.

The slipper limpet, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), is well-represented in current and historical research literature because of its utility as a developmental model and because of its widespread impacts as an invasive species. It served as a foundational example of spiralian development in the classic age of experimental embryology1 and has experienced a rebirth of interest with the application of modern imaging and genomic tools to dissect mechanisms of lophotrochozoan early development2,3. At the other end of its life history, other investigations have focused on the impacts of adult populations of this ecosystem engineer in temperate coastal marine environments far removed from its original distribution in eastern North America4,5. In between embryo and adult, the veliger larvae of this species have been subjects of numerous studies of larval development and ecology, especially of factors influencing growth and acquisition of competence for metamorphosis, the internal and external cues mediating larval settlement, and the effects of larval experience on juvenile performance6,7,8,9,10,11. Recent studies have revealed the resilience of larvae and juveniles of C. fornicata to ocean acidification, yet another avenue for productive research use of this animal12,13,14,15,16.
An advantage of C. fornicata for studies of marine larval biology is that it is relatively easy to grow in the laboratory in natural or artificial seawater on a unialgal diet of the flagellate Isochrysis galbana. Culture methods have been detailed by the author in an earlier methods-focused print publication17. The reasons for the present contribution are twofold. First, the routine physical maneuvers involved in establishing and caring for cultures are conceptually very simple but difficult to perform correctly without hands-on or video demonstration. Second, two variations on previously described culture methods are described that are especially suited to laboratory and field studies of responses to environmental stressors such as ocean acidification, eutrophication, and oxygen depletion. The first of these is a low-volume (800 mL) culture system suited for manipulation of pH and dissolved oxygen in seawater via small volumes of bubbled gases, and the second is a larger volume (15 L) mesocosm system that can be placed in the field and that allows free exchange of ambient seawater.

מחבר זרקור: גישור על הפער בין תצפיות שדה לבין מניפולציות מעבדה במחקר אקולוגיה של זחלים

מעבדה ותרבית שדה של זחלים של צלע נעלי בית, Crepidula fornicata

I'm interested in how the development of marine larvae is influenced by multiple environmental factors and stressors and how the larval nervous system integrates information from the environment to regulate settlement of larvae, metamorphosis to benthic juveniles, and recruitment into adult populations. Larvae of some marine species like the Slipper Limpet, Crepidula Fornicata, are quite resilient to ocean acidification, but there are important interactions between acidification and other factors, like nutrition and salinity. We don't know very much about how larvae grow, develop, and behave in nature.Field mesocosm observations can fill in some of these gaps and suggest hypotheses to test with lab manipulations. We can begin to ask on neurobehavioral, developmental, and transcriptional levels how larvae deal with stressors that vary on short time scales in productive coastal environments that are especially susceptible to human impacts.

גדילת הזחלים ורכישת כשירות למטמורפוזה נמדדו ב-4 העתקים סימולטניים של תרביות מאווררות בנפח 800 מ"ל, שכל אחת מהן הכילה 160 זחלים, שמקורם בקבוצת אחים של זחלים שבקעו ממסת ביצה אחת והוזנו באיזוכריזיס גלבנה בצפיפות של 1X105 תאים/מ"ל. ה- pH היה 7.9-8.0, הטמפרטורה הייתה 20-21 מעלות צלזיוס, והמליחות הי?...

Read this Scientific Article Protocol about Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata at JoVE.com

המאמר מציג שיטות לתרבית זחלים של הגסטרופוד Crepidula fornicata במערכת בקנה מידה מעבדתי קטן ובמערכת מזוקוסמוס של מי ים שניתן לפרוס בשטח.

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded ...

אני מתעניינת באופן שבו התפתחות הזחלים הימיים מושפעת מגורמים סביבתיים רבים ומגורמי עקה וכיצד מערכת העצבים של הזחלים משלבת מידע מהסביבה כדי לווסת התיישבות של זחלים, מטמורפוזה לצעירים בנתיים וגיוס לאוכלוסיות בוגרות. הזחלים של כמה מינים ימיים כמו גפת הסליפר, Crepidula Fornicata, עמידים למדי להחמצת האוקיינוסים, אך יש אינטראקציות חשובות בין החמצה לבין גורמים אחרים, כמו תזונה ומליחות. איננו יודעים הרבה על האופן שבו הזחלים גדלים, מתפתחים ומתנהגים בטבע.תצפיות מזוקוסמוס שדה יכולות למלא חלק מהפערים הללו ולהציע השערות לבדיקה באמצעות מניפולציות מעבדה. אנו יכולים להתחיל לשאול ברמה הנוירו-התנהגותית, ההתפתחותית והשעתיק כיצד הזחלים מתמודדים עם גורמי עקה המשתנים בסקאלות זמן קצרות בסביבות חוף יצרניות הרגישות במיוחד להשפעות אנושיות.

laboratory-field-culture-larvae-slipper-limpet-crepidula

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory and Field Culture of Larvae of The Slipper Limpet, Crepidula fornicata

224 Views.  Dickinson College. אני מתעניינת באופן שבו התפתחות הזחלים הימיים מושפעת מגורמים סביבתיים רבים ומגורמי עקה וכיצד מערכת העצבים של הזחלים משלבת מידע מהסביבה כדי לווסת התיישבות של זחלים, מטמורפוזה לצעירים בנתיים וגיוס לאוכלוסיות בוגרות. הזחלים של כמה מינים ימיים כמו גפת הסליפר, Crepidula Fornicata, עמיד?...

Video: מחבר זרקור: גישור על הפער בין תצפיות שדה לבין מניפולציות מעבדה במחקר אקולוגיה של זחלים

The calyptraeid gastropod mollusk, Crepidula fornicata, has been widely used for studies of larval developmental biology, physiology, and ecology. Brooded veliger larvae of this species were collected by siphoning onto a sieve after natural release by adults, distributed into the culture at a density of 200/L, and fed with Isochrysis galbana (strain T-ISO) at 1 x 105 cells/mL. Shell growth and acquisition of competence for metamorphosis were documented for sibling larvae reared in ventilated 800 mL cultures designed for equilibration to ambient air or to defined atmospheric gas mixtures. Contrasting with these laboratory culture conditions; growth and competence data were also collected for larvae reared in a 15 L flow-through ambient seawater mesocosm located in a field population of reproductive adults. Growth rates and timing of metamorphic competence in the laboratory cultures were similar to those reported in previously published studies. Larvae reared in the field mesocosm grew much faster and metamorphosed sooner than reported for any laboratory studies. Together, these methods are suited for exploring larval development under predetermined controlled conditions in the laboratory as well as under naturally occurring conditions in the field.

The paper presents methods for larval culture of the gastropod Crepidula fornicata in a small-volume laboratory-scale system and in an ambient-seawater mesocosm system that can be deployed in the field.

Collection of Larvae of Crepidula fornicata for Laboratory and Field Cultures

To begin, stop the aeration of the jar containing the adult Crepidula fornicata. Let the jar stand for 15 to 20 minutes to allow for debris sedimentation. Next, fix a short length of five millimeter wide glass tubing to a soft plastic aquarium tubing.Once the larvae swim up, place a sieve over a 600 milliliter glass beaker, then siphon the larvae through the tubing into the sieve. Lift the sieve briefly, invert it and squirt filtered sea water on the bottom of the sieve to rinse the larvae into a glass bowl with filtered sea water.

אוסף זחלים של Crepidula fornicata לתרביות מעבדה ושדה

Construction of Ventilated Cultures for Larvae of Crepidula fornicata

To begin, drill two five millimeter holes in lid of jar. Install a tubing barb in each hole using a 10-32 nylon nut. Apply a dab of silicone rubber aquarium sealant on the aperture of the threaded inner portion of a tubing barb.Push a 20 centimeter long, two millimeter wide polyethylene tubing through the aperture. Allow the sealant at the end of the tubing to cure, then trim the protruding end, so that it is flush with the end of the tubing barb.

בניית תרביות מאווררות לזחלים של Crepidula fornicata

Setup and Routine Maintenance of Laboratory Cultures of Crepidula fornicata

To begin, place a glass bowl containing the larvae of Crepidula fornicata on the stage of a dissecting microscope. With a Pasteur pipette, manually transfer and count the desired number of larvae into a culture jar containing filtered sea water. Feed the larvae with an appropriate volume of microalgae.Add filtered sea water to bring the culture volume to within one centimeter of the shoulder of the jar. Screw down the lid of culture jar and connect the ventilation air supply to the barb fitting on the tubing leading to the jar's bottom. Use an aquarium air pump with common aquarium gang valves to supply ventilation with ambient air.Then adjust the air flow to yield a steady, slow stream of bubbles. To replace the culture water, pour the contents of the jar into a sieve over a beaker. Invert the sieve over the culture jar containing fresh, filtered sea water, then use a squirt bottle of filtered sea water to rinse the larvae into the jar.Add some microalgae as feed for the larvae and top off the jar with filtered sea water to within one centimeter of the jar's shoulder. The larvae of Crepidula fornicata appear to grow slower in the laboratory cultures relative to the mesocosm cultures. The larvae started to metamorphos by day eight, and were all competent for metamorphosis by day 12.

הקמה ותחזוקה שוטפת של תרביות מעבדה של Crepidula fornicata

Field-Deployable Mesocosm Culture of the Larvae of Crepidula fornicata

To begin, use a handheld electric saber saw to cut four evenly spaced rectangular openings into the sides of a standard 7 gallon polyethylene bucket. With a table saw, slice the cutout pieces lengthwise into 2 centimeter wide strips. Cut out four panels of nylon mesh to overlap the cutout openings of the bucket.Temporarily secure one edge of a mesh panel over the long edge of a cutout with small spring clamps. Now glue the edge of the mesh panel to the bucket opening with hot glue. Once the first edge is fastened, glue down the other edges while maintaining a top tension on the panel.Next, trim down the ends of the cutout pieces so that they fit over the glued area of the panel. Press each covering strip in place with a liberal amount of hot melt glue. Finally, secure the end of each strip with a nylon blind rivet installed from outside the bucket.Use a utility razor to trim the excess glue and mesh from the edges of the reinforcing strips. The larvae of Crepidula Fornicata appeared to grow faster in the mesocosm relative to the laboratory cultures. The larvae metamorphose spontaneously between the fifth and sixth day.Almost all the larvae had metamorphosed by day seven.