ניתן לנהל טוב יותר את רוב המצבים הבריאותיים אם הם מתגלים מוקדם. סמנים ביולוגיים הזמינים בנוזלי גוף נגישים הם הדרכים המבטיחות ביותר לזיהוי מוקדם של מצבים בריאותיים. אנו מדווחים על שיפורים בשיטות לחקירת סמנים ביולוגיים של מיקרו-רנ"א המשתחררים דרך שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות ממוח האדם.
שיטה זו אפשרה לנו לזהות שונות במטענים שלפוחיתיים קטנים חוץ-תאיים בין תת-סוגים גנטיים שונים של מחלות, כגון דמנציה, יכולה לזהות סמנים ביולוגיים מועמדים למטען שניתן לזהות בנוזלים היקפיים, ולשפר את האבחון המוקדם של מחלה. אז פרוטוקול זה מאזן בין יעילות, נגישות וטוהר המוצר, מה שהופך אותו לשחזור בקלות בסביבות מעבדה שונות. זה לא דורש שום ציוד מיוחד ועמודות ארוזות מראש מספקות עקביות.
לכן, כל ממצאי סמן ביולוגי יתורגמו בקלות לתוצאה קלינית רצויה. עם אישור תרופות חדשות לשינוי מחלות, האבחון צריך לקחת את המחלות הללו הרבה יותר מוקדם מהאפשרי כיום כדי למקסם את התועלת למטופלים. שיטות כאלה יובילו לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים של מיקרו-רנ"א רלוונטיים למחלה, שיכולים לגרום לניהול בריאות טוב יותר באמצעות אפשרויות טיפול וטיפול ספציפיות.
נשתמש ביכולות הקיימות שלנו כדי לפתח שיטות לזיהוי סמנים ספציפיים לרקמות ולסוג התא שיכולים לזהות סמנים ביולוגיים של מיקרו-רנ"א המשתחררים מסוג תא ספציפי בתוך תערובת הטרוגנית הנמצאת בנוזלי הגוף. כדי להתחיל, פורסים דק 250 מיליגרם של רקמת מוח קפואה באמצעות אזמל מעוקר על צלחת קרה. הוסף לרקמה שני מיליליטר של 75 יחידות למיליליטר קולגנאז מסוג III בתמיסת שינה.
מניחים כל דגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בסימן חמש הדקות, הפוך את הדגימה פעמיים לערבוב. לאחר 10 דקות, פיפטה בעדינות את הדגימה שלוש פעמים באמצעות פס פלסטיק חד פעמי של 10 מיליליטר.
לאחר מכן הניחו כל דגימה על קרח, והוסיפו קוקטייל מעכב פרוטאז ומעכב פוספטאז לכל דגימה. צנטריפוגה כל דגימת רקמת מוח ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט.
ואז צנטריפוגה ב-2000G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת אספו את הסופרנטנט וסננו אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן צנטריפוגה את המסנן ב-10,000 גרם למשך 48 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר איסוף הסופרנטנט, הוסיפו מאגר משקעים לכל דגימה ביחס של שניים לאחד. ודגרו את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן צנטריפוגה כל דגימה ב-10,000 גרם למשך 96 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ולהשעות את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS ללא שלפוחית חוץ-תאית. אזנו את כרומטוגרפיית אי הכללת הגודל שהוכנה מראש או עמודת SEC בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שיווי המשקל, הסר את המאגר המשמר מראש העמוד, ושטוף את העמוד פעמיים באמצעות 250 מיקרוליטר PBS ללא שלפוחית חוץ-תאית.
לאחר מכן הוסף את הגלולה המושעה לעמוד ולצנטריפוגה ב-50G למשך 30 שניות. לאחר השלכת הזרימה, הוסף 180 מיקרוליטר של PBS נטול EV, וצנטריפוגה את העמודה ב-50G למשך דקה אחת כדי לאפשר לשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן במוח להתרוקן. כדי לכינים שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות, יש לדלל את דגימת השלפוחית החוץ-תאית הקטנה המבודדת ביחס שווה עם מאגר ליזה ומיצוי.
מערבבים את הדגימה המדוללת בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-14,000 גרם למשך 15 דקות. אסוף את חומר החלבון ומדוד את ריכוזי החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון.
כדי לבצע ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, יש לדלל כל דגימה ב-PBS באמצעות גורם דילול של 1 עד 1000. הזרקו את הדגימה למכשיר ה-NTA. והגדר את המכשיר לקרוא את הדגימה באורך גל של 550 ננומטר.
השתמש בכמות החלקיקים כדי למדוד את כמות החלבון לחלקיק המתבטאת בגרם פמטו בהתאם להנחיות MISEV. לאחר מכן, יש לדלל את צבע מסכת התא הכתום או ה-CMO ב-PBS במקדם דילול של 1 עד 1000. לאחר מכן יש לדלל את צבע ה-CMO עם דגימת השלפוחית החוץ-תאית הקטנה באמצעות גורם דילול של 1 עד 10.
ודוגרים את התערובת בחושך למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת, יש לדלל את תערובת השלפוחית החוץ-תאית הקטנה של צבע CMO עוד יותר באמצעות PBS במקדם דילול של 1 עד 1000. בעזרת מכשיר ה-NTA, קרא את צבע ה-CMO של כל דגימת שלפוחית חוץ-תאית קטנה באורך גל של 550 ננומטר.
למעקב אחר נוגדנים פלואורסצנטיים, יש לדלל כל טטרספאן ונוגדנים פלואורסצנטיים ב-PBS באמצעות גורם דילול של 1 עד 10. לאחר מכן יש לדלל כל צבע נוגדנים עם דגימת השלפוחית החוץ-תאית הקטנה באמצעות גורם דילול של 1 עד 10. ודוגרים את התערובת בחושך במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, יש לדלל את תערובת הנוגדנים השנייה באמצעות PBS עם מקדם דילול של 1 עד 1000. קרא את אותות הנוגדנים הפלואורסצנטיים של דגימת השלפוחית החוץ-תאית הקטנה באורך גל של 550 ננומטר באמצעות מכשיר NTA. ניתוח כתמים מערביים אישר את נוכחותם של הסמנים החיוביים CD9, CD63, CD81, Flotilla One ו-TSG101 בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן במוח, בעוד שקלנקסין נעדר מה שמצביע על כך שאין זיהום תאי.
ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים גילה כי החלקיקים המבודדים נעו בין 50 ל-200 ננומטר עם ריכוז שיא בסביבות 100 ננומטר. נתוני צביעת CMO הראו כי ל-52.35% מהחלקיקים יש שכבת שומנים, מתוכם 34.66% הכילו CD9, 15.49% הכילו CD63 ו-12.01% הכילו CD81.
