Большинство состояний здоровья можно лучше контролировать, если выявить их на ранней стадии. Биомаркеры, доступные в доступных жидкостях организма, являются наиболее перспективными способами раннего выявления заболеваний. Мы сообщаем об улучшении методов исследования биомаркеров микроРНК, высвобождаемых через небольшие внеклеточные везикулы из мозга человека.
Этот метод позволил нам выявить различия в малых внеклеточных везикальных грузах между различными генетическими подтипами заболеваний, такими как деменция, идентифицировать кандидатов в биомаркеры груза, которые могут быть обнаружены в периферических жидкостях, и улучшить раннюю диагностику заболеваний. Таким образом, этот протокол сочетает в себе эффективность, доступность и чистоту продукта, что делает его легко воспроизводимым в различных лабораторных условиях. Он не требует какого-либо специализированного оборудования, а предварительно упакованные колонны обеспечивают консистенцию.
Таким образом, любые результаты биомаркеров будут легко переведены в желаемый клинический результат. С принятием новых препаратов, модифицирующих болезнь, диагностика должна выявлять эти заболевания гораздо раньше, чем это возможно в настоящее время, чтобы максимизировать пользу для пациента. Подобные методы приведут к выявлению новых биомаркеров микроРНК, имеющих отношение к заболеванию, что может привести к лучшему управлению здоровьем с использованием конкретных вариантов лечения и ухода.
Мы будем использовать наши существующие возможности для разработки методов идентификации маркеров, специфичных для тканей и типов клеток, которые могут обнаруживать биомаркеры микроРНК, высвобождаемые из определенного типа клеток в гетерогенной смеси, обнаруженной в жидкостях организма. Для начала тонко нарежьте 250 миллиграммов замороженной мозговой ткани с помощью стерилизованного скальпеля на холодной тарелке. Добавьте в ткани два миллилитра по 75 единиц на миллилитр коллагеназы III типа в растворе гибернации.
Поместите каждый образец на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. На пятиминутной отметке дважды переверните образец для перемешивания. На 10-минутной отметке аккуратно трижды нанесите образец с помощью пластиковой одноразовой полоски объемом 10 миллилитров.
Затем поместите каждый образец на лед и добавьте к каждому образцу коктейль ингибиторов протеазы и ингибитор фосфатазы. Центрифугируйте каждый образец ткани мозга при температуре 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость.
А затем центрифугировать его при температуре 2000G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтр 0,22 микрометра. Затем центрифугируйте фильтрат при температуре 10 000 G в течение 48 минут при четырех градусах Цельсия.
После сбора надосадочной жидкости добавьте буфер осадков к каждому образцу в соотношении два к одному. И инкубируйте образец в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте каждый образец при температуре 10 000 G в течение 96 минут при четырех градусах Цельсия.
И ресуспендировать гранулу в 100 микролитрах внеклеточного пузырькового PBS, свободного от везикул. Уравновесьте заранее подготовленную методом эксклюзионной хроматографии или колонку SEC при комнатной температуре в течение 15 минут. После уравновешивания удалите консервирующий буфер с верхней части колонки и дважды промойте колонку, используя 250 микролитров внеклеточного PBS, свободного от везикул.
Затем добавьте ресуспендированную гранулу в колонку и центрифугируйте при 50G в течение 30 секунд. После удаления потока добавьте 180 микролитров PBS без EV и центрифугируйте колонку при 50G в течение одной минуты, чтобы позволить полученным мозгом небольшим внеклеточным везикулам вымыться. Чтобы вывести мелкие внеклеточные везикулы, разведите выделенный образец мелких внеклеточных везикул в равном соотношении с лизисом и экстракционным буфером.
Разбавленный образец взбалтывайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец при 14 000G в течение 15 минут. Соберите надосадочную жидкость белка и измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка.
Чтобы выполнить анализ отслеживания наночастиц, разбавьте каждый образец в PBS с коэффициентом разбавления от 1 до 1000. Введите образец в прибор NTA. И настройте прибор на считывание образца на длине волны 550 нанометров.
Используйте количество частиц для измерения количества белка на частицу, выраженного в фемтограммах, в соответствии с рекомендациями MISEV. Далее разбавьте клеточную маску оранжевым или CMO красителем в PBS с коэффициентом разбавления 1 к 1000. Затем разбавьте краситель CMO образцом мелких внеклеточных везикул, используя коэффициент разведения от 1 до 10.
И выдерживаем смесь в темноте 30 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь разбавьте смесь малых внеклеточных везикул красителем CMO с помощью PBS с коэффициентом разведения от 1 до 1000. С помощью инструмента NTA считывайте краситель CMO каждого образца маленького внеклеточного везикулы на длине волны 550 нанометров.
Для отслеживания флуоресцентных антител разбавляйте каждый тетраспан и флуоресцентное антитело в PBS с использованием коэффициента разведения от 1 до 10. Затем разбавляют каждый краситель антител образцом мелких внеклеточных везикул, используя коэффициент разведения от 1 до 10. И выдержать смесь в темноте в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.
Далее разведите вторую смесь антител с помощью PBS с коэффициентом разведения 1 к 1000. Считывание сигналов флуоресцентных антител образца малых внеклеточных везикул на длине волны 550 нанометров с помощью инструмента NTA. Вестерн-блоттинг подтвердил наличие положительных маркеров CD9, CD63, CD81, Flotilla One и TSG101 в малых внеклеточных везикулах головного мозга, в то время как Calnexin отсутствовал, что указывает на отсутствие клеточного загрязнения.
Анализ отслеживания наночастиц показал, что размер изолированных частиц варьировался от 50 до 200 нанометров с пиковой концентрацией около 100 нанометров. Данные окрашивания CMO показали, что 52,35% частиц имеют липидный бислой, из которых 34,66% содержали CD9, 15,49% содержали CD63 и 12,01% содержали CD81.
