يمكن إدارة معظم الحالات الصحية بشكل أفضل إذا تم اكتشافها مبكرا. المؤشرات الحيوية المتوفرة في سوائل الجسم التي يمكن الوصول إليها هي أكثر الطرق الواعدة للكشف المبكر عن الحالات الصحية. نحن نبلغ عن تحسينات في طرق التحقيق في المؤشرات الحيوية للحمض النووي الريبي الصغير المنبعثة عبر حويصلات صغيرة خارج الخلية من الدماغ البشري.
سمحت لنا هذه الطريقة بتحديد التباين في الشحنات المثانية الصغيرة خارج الخلية بين الأنواع الفرعية الجينية المختلفة من المرض ، مثل الخرف ، ويمكن تحديد المرشحين للعلامات الحيوية للشحن التي يمكن اكتشافها في السوائل الطرفية ، وتعزيز التشخيص المبكر للمرض. لذلك يوازن هذا البروتوكول بين الكفاءة وإمكانية الوصول ونقاء المنتج ، مما يجعله قابلا للتكرار بسهولة عبر بيئات المختبرات المختلفة. لا يتطلب أي معدات متخصصة والأعمدة المعبأة مسبقا توفر الاتساق.
لذلك ، ستترجم أي نتائج للمؤشرات الحيوية بسهولة إلى النتيجة السريرية المرجوة. مع الموافقة على أدوية جديدة لتعديل المرض ، يحتاج التشخيص إلى تناول هذه الأمراض في وقت أبكر بكثير مما هو ممكن حاليا لتعظيم فائدة المريض. ستؤدي مثل هذه الأساليب إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة ذات الصلة بالمرض microRNA ، والتي يمكن أن تؤدي إلى إدارة صحية أفضل باستخدام خيارات علاج ورعاية محددة.
سنستخدم قدراتنا الحالية لتطوير طرق لتحديد العلامات الخاصة بالأنسجة ونوع الخلايا التي يمكنها اكتشاف المؤشرات الحيوية للحمض النووي الريبي الميكروي المنبعثة من نوع معين من الخلايا داخل خليط غير متجانس موجود في سوائل الجسم. للبدء ، قم بتقطيع 250 ملليغرام من أنسجة المخ المجمدة إلى شرائح رفيعة باستخدام مشرط معقم على طبق بارد. أضف ملليلترين من 75 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز من النوع الثالث في محلول السبات إلى الأنسجة.
ضع كل عينة في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عند علامة الخمس دقائق ، اقلب العينة مرتين للخلط. عند علامة 10 دقائق ، قم بماصة العينة برفق ثلاث مرات باستخدام شريط بلاستيكي قابل للتصرف سعة 10 ملليلتر.
ثم ضع كل عينة على الثلج ، وأضف كوكتيل مثبط البروتياز ومثبط الفوسفاتيز لكل عينة. الطرد المركزي لكل عينة من أنسجة المخ عند 300 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية.
ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 2000 جرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. الآن اجمع المادة الطافية وقم بتصفيتها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. ثم قم بالطرد المركزي للمرشح عند 10 ، 000 جم لمدة 48 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد جمع المادة الطافية ، أضف المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى كل عينة بنسبة اثنين إلى واحد. واحتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم الطرد المركزي لكل عينة عند 10 ، 000 جم لمدة 96 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS الخالي من الحويصلة خارج الخلية. قم بموازنة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المعدة مسبقا أو عمود SEC في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد التوازن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للمادة الحافظة من أعلى العمود ، واغسل العمود مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من PBS الخالي من الحويصلة خارج الخلية.
ثم أضف الحبيبات المعلقة إلى العمود وجهاز الطرد المركزي عند 50G لمدة 30 ثانية. بعد التخلص من التدفق ، أضف 180 ميكرولترا من PBS الخالي من EV ، وقم بالطرد المركزي للعمود عند 50G لمدة دقيقة واحدة للسماح للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الدماغ بالاستئصال. لقمل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، قم بتخفيف عينة الحويصلة الصغيرة المعزولة خارج الخلية بنسبة متساوية مع محلول التحلل والاستخراج.
حرك العينة المخففة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 14 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة. اجمع المادة الطافية للبروتين وقم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين.
لإجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، قم بتخفيف كل عينة في PBS باستخدام عامل تخفيف من 1 إلى 1000. حقن العينة في أداة NTA. واضبط الجهاز لقراءة العينة بطول موجي 550 نانومتر.
استخدم كمية الجسيمات لقياس كمية البروتين لكل جسيم معبرا عنها بجرام الفيمتو وفقا لإرشادات MISEV. بعد ذلك ، قم بتخفيف قناع الخلية البرتقالي أو صبغة CMO في PBS بعامل تخفيف من 1 إلى 1000. ثم قم بتخفيف صبغة CMO بعينة الحويصلة الصغيرة خارج الخلية باستخدام عامل تخفيف من 1 إلى 10.
ويحتضن الخليط في الظلام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. الآن ، قم بتخفيف خليط الحويصلة الصغيرة خارج الخلية لصبغة CMO باستخدام PBS بعامل تخفيف من 1 إلى 1000. باستخدام أداة NTA ، اقرأ صبغة CMO لكل عينة حويصلة صغيرة خارج الخلية بطول موجي يبلغ 550 نانومتر.
لتتبع الأجسام المضادة الفلورية ، قم بتخفيف كل جسم مضاد رباعي وفلورسنت في PBS باستخدام عامل تخفيف من 1 إلى 10. ثم قم بتخفيف كل صبغة من صبغة الأجسام المضادة بعينة حويصلة صغيرة خارج الخلية باستخدام عامل تخفيف من 1 إلى 10. واحتضان الخليط في الظلام لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بتخفيف خليط الأجسام المضادة الثاني باستخدام PBS بعامل تخفيف من 1 إلى 1000. اقرأ إشارات الأجسام المضادة الفلورية لعينة الحويصلة الصغيرة خارج الخلية بطول موجي يبلغ 550 نانومتر باستخدام أداة NTA. أكد تحليل اللطخة الغربية وجود العلامات الإيجابية CD9 و CD63 و CD81 و Flotilla One و TSG101 في الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الدماغ ، بينما كان Calnexin غائبا مما يشير إلى عدم وجود تلوث خلوي.
كشف تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن الجسيمات المعزولة تراوحت بين 50 إلى 200 نانومتر في الحجم مع ذروة تركيز تبلغ حوالي 100 نانومتر. أظهرت بيانات تلطيخ CMO أن 52.35٪ من الجسيمات تحتوي على طبقة ثنائية دهنية ، منها 34.66٪ تحتوي على CD9 ، و 15.49٪ تحتوي على CD63 ، و 12.01٪ تحتوي على CD81.
