A maioria das condições de saúde pode ser melhor gerenciada se detectada precocemente. Os biomarcadores disponíveis em fluidos corporais acessíveis são as formas mais promissoras para a detecção precoce de problemas de saúde. Estamos relatando melhorias nos métodos de investigação de biomarcadores de microRNA liberados por meio de pequenas vesículas extracelulares do cérebro humano.
Este método nos permitiu identificar a variação em pequenas cargas vesicais extracelulares entre diferentes subtipos genéticos de doenças, como demência, pode identificar candidatos a biomarcadores de carga que podem ser detectados em fluidos periféricos e melhorar o diagnóstico precoce da doença. Portanto, esse protocolo equilibra eficiência, acessibilidade e pureza do produto, tornando-o facilmente reproduzível em diferentes ambientes de laboratório. Não requer nenhum equipamento especializado e as colunas pré-embaladas fornecem consistência.
Portanto, quaisquer achados de biomarcadores serão facilmente traduzidos em um resultado clínico desejado. Com a aprovação de novos medicamentos modificadores da doença, o diagnóstico precisa resolver essas doenças muito mais cedo do que é possível atualmente para maximizar o benefício do paciente. Métodos como esse levarão à identificação de novos biomarcadores de microRNA relevantes para a doença, o que pode resultar em um melhor gerenciamento da saúde usando opções específicas de tratamento e cuidados.
Usaremos nossos recursos existentes para desenvolver métodos para identificar marcadores específicos de tecido e tipo de célula que possam detectar biomarcadores de microRNA liberados de um tipo de célula específico dentro de uma mistura heterogênea encontrada em fluidos corporais. Para começar, corte em fatias finas 250 miligramas de tecido cerebral congelado usando um bisturi esterilizado em uma placa fria. Adicione dois mililitros de 75 unidades por mililitro de colagenase Tipo III em solução de hibernação ao tecido.
Coloque cada amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Na marca de cinco minutos, inverta a amostra duas vezes para misturar. Na marca de 10 minutos, pipetar suavemente a amostra três vezes usando uma tira descartável de plástico de 10 mililitros.
Em seguida, coloque cada amostra no gelo e adicione o coquetel inibidor de protease e o inibidor de fosfatase a cada amostra. Centrifugue cada amostra de tecido cerebral a 300G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante.
E então centrifugue a 2000G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Agora colete o sobrenadante e filtre-o através de um filtro de 0,22 micrômetro. Em seguida, centrifugue o filtrado a 10.000 g por 48 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de coletar o sobrenadante, adicione tampão de precipitação a cada amostra em uma proporção de dois para um. E incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue cada amostra a 10.000 G por 96 minutos a quatro graus Celsius.
E ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS livre de vesículas extracelulares. Equilibre a cromatografia de exclusão de tamanho pré-preparada ou a coluna SEC à temperatura ambiente por 15 minutos. Após o equilíbrio, remova o tampão conservante do topo da coluna e lave a coluna duas vezes usando 250 microlitros de PBS livre de vesículas extracelulares.
Em seguida, adicione o pellet ressuspenso à coluna e centrifugue a 50G por 30 segundos. Depois de descartar o fluxo, adicione 180 microlitros de PBS livre de EV e centrifugue a coluna a 50G por um minuto para permitir que pequenas vesículas extracelulares derivadas do cérebro eluam. Para piolhos de pequenas vesículas extracelulares, dilua a amostra isolada de pequenas vesículas extracelulares em uma proporção igual com lise e tampão de extração.
Agitar a amostra diluída a quatro graus Celsius durante 30 minutos. Em seguida, centrifugue a amostra a 14.000 g por 15 minutos. Coletar o sobrenadante de proteína e medir as concentrações de proteína usando um kit de ensaio de proteína.
Para realizar a análise de rastreamento de nanopartículas, dilua cada amostra em PBS usando um fator de diluição de 1 a 1000. Injetar a amostra no instrumento NTA. E configure o instrumento para ler a amostra em um comprimento de onda de 550 nanômetros.
Use a quantidade de partículas para medir a quantidade de proteína por partícula expressa em femto gramas de acordo com as diretrizes do MISEV. Em seguida, dilua a máscara celular laranja ou corante CMO em PBS por um fator de diluição de 1 a 1000. Em seguida, diluir o corante CMO com a pequena amostra de vesícula extracelular usando um fator de diluição de 1 a 10.
E incube a mistura no escuro por 30 minutos a quatro graus Celsius. Agora, dilua ainda mais a mistura de pequenas vesículas extracelulares do corante CMO usando PBS em um fator de diluição de 1 a 1000. Usando o instrumento NTA, leia o corante CMO de cada pequena amostra de vesícula extracelular em um comprimento de onda de 550 nanômetros.
Para rastreamento de anticorpos fluorescentes, dilua cada tetraspan e anticorpo fluorescente em PBS usando um fator de diluição de 1 a 10. Em seguida, diluir cada corante de anticorpos com a pequena amostra de vesícula extracelular usando um fator de diluição de 1 a 10. E incube a mistura no escuro por duas horas a quatro graus Celsius.
Em seguida, diluir a segunda mistura de anticorpos usando PBS com um fator de diluição de 1 a 1000. Leia os sinais de anticorpos fluorescentes da pequena amostra de vesícula extracelular em um comprimento de onda de 550 nanômetros usando o instrumento NTA. A análise de Western blot confirmou a presença dos marcadores positivos CD9, CD63, CD81, Flotilla One e TSG101 em pequenas vesículas extracelulares derivadas do cérebro, enquanto a Calnexina estava ausente, indicando que não havia contaminação celular.
A análise de rastreamento de nanopartículas revelou que as partículas isoladas variavam entre 50 a 200 nanômetros de tamanho, com um pico de concentração em torno de 100 nanômetros. Os dados de coloração CMO mostraram que 52,35% das partículas possuem bicamada lipídica, das quais 34,66% continham CD9, 15,49% continham CD63 e 12,01% continham CD81.
