עבודה זו מומנה על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (מענק # 249669, ו# 482986) ולב ושבץ קרן של קנדה (מענק # 485508). המחברים מודים יוסוף אל האייק וואן ד&quot;ר צ&#39;י על סיועם בפיתוח פרוטוקולי הניסוי.

כל ההליכים כרוכים בטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טורונטו ועדת טיפול בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות (פרוטוקול לא. 20009387). השיטות הבאות יש לבצע באמצעות כלים וטכניקות סטריליות, במכסת מנוע זרימה למינרית היכן שאפשר. בטקסט הפרוטוקול להלן, הביטוי &quot;EFH-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת עם גורם צמיחה אפידרמיס, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והפרין. EFH-SFM משמש כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs עבר התמיינות בגלל mitogens אלה לשמור NPCs ב4 המדינה המובחנות שלהם. כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs המושרה להתמיין לסוגי תאים בוגרים, &quot;FBS-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת סרום שור עוברי 1%. FBS מקדם את הבידול של NPCs לפנוטיפים בשלים עצביים 5. 1. בידוד ותרבות של מבשרים עצביים (לאשמוצג בסרטון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש CD1 עכבר (6-8 שבועות) עם isofluorane והקרבה באמצעות פריקת צוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את הראש באתנול 70% ולערוף את החיה במספריים חדים נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את הראש עם מלקחיים כירורגיים, הסר את העור על פני שטח הגבו לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל ולא. 11 להב, להבקיע את הגולגולת בסינוס המצח לאורך ציר mediolateral, וגם לאורך תפר sagittal בכיוון rostrocaudal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את העצמות הקודקודית מהראש ללא. 7 מלקחיים מעוגלים, נזהרים שלא לנקב את רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מרית דקה מתחת למוח מתחיל מתחת למוח הקטן והתקדם לעבר נורות חוש הריח. בעוד מחזיק את הגולגולת במקום עם מלקחיים, משוך בעדינות את המוח מהגולגולת ולמקם אותו באופן מיידי בנוזל השדרתי מלאכותי קר כקרח (ראה מתכונים בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ נתיחה, באמצעות סטרילימספריים ומלקחי נתיחה יחתכו את המוח במחצית לאורך קו האמצע. סובב אונה כל כך שהמשטח המדיאלי (חתך) פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חצי כדור, ועם פני השטח המדיאלי פונים כלפי מעלה, אתר splenium של כפיס המוח (אזור אחורי של כפיס המוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך מפני השטח של קליפת המוח לsplenium של כפיס המוח לאורך ציר dorsoventral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולף את הקליפה החרוטה כלפי נורת הריח לחשוף את הקירות המדיאלי וצדדיים של חדר הצדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הכדור, כך שהמשטח הגבה פונה כלפי מעלה, ולהשתמש microscissors המעוגל לגזור ולאסוף את הקירות החשופים המדיאלי וצדדיים, שמכילים את האזור שבו periventricular NPCs מתגורר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.8-1.11 לאונה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הרקמות המבודדות ל7 מ&quot;ל של פתרון טריפסין (ראה מתכון בהמשך) בצינור סמ&quot;ק 15, ולמקם את הצינור על כיסא נדנדה ב37 מעלות צלזיוסחממה על 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ורקמות ב2 מ&quot;ל של תמיסת מעכב טריפסין (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות triturate רקמות עם 30-50 פעמי פיפטה קטנות קידוח פסטר בזהירות כדי להימנע מבועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend וב1-2 מ&quot;ל של SFM (ראה מתכון בהמשך) על ידי triturating הגלולה 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד ל3 דקות, לשאוב 1 מיליליטר supernatant ו resuspend בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירה לחיות צפיפות תאים עם haemocytometer וצלחת התאים בבקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים לμl בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשה התרבות לצמוח במשך 7 ימים ללא הפרעה להניב neurospheres העיקרי צף מורכב מNPCs. </li></ol> 2. הכנת Galvanotaxis הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זכוכית מרובעת 3 לא. 1 תלושי כיסוי (22 x 22 x 0.17 מ&quot;מ) אניבקבוק na של 6N חומצה הידרוכלורית בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, השתמשו יהלום קצה של כוס מחתך לחתוך 6 רצועות מלבניות (22 X 5 X 0.17 מ&quot;מ) של זכוכית מלא מרובע. 1 תלושי עטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התלושים המרובעים חומצה השטופות וחוטרים מלבניים למכסת מנוע זרימה למינרית. שוטף את הרצועות הראשונות עם אתנול 70% המלבניות ומרובעות, עם מי autoclaved תרבות כיתת רקמות, ולאפשר לו להתייבש על קים נגב (על סטריליות הוסיפה, הזכוכית ניתן לאפשר לו להתייבש באוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום להיקף של פני שטח באחת שקופיות הזכוכית המרובעות, ולאטום אותם לבסיס של 60 צלחות פטרי פלסטיק מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום לאורך הציר הארוך של משטח אחד מרצועות הזכוכית המלבניות, ולאטום אותם לקצוות שונים של שקופיות הזכוכית המרובעות (כזה שהם מקבילים זה לזה) על מנת ליצור שוקת מרכזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV-לעקר את התאים לפחות 15 דקות במכסת מנוע הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250-300 μl פיפטה של ​​פולי-L-lysiנה אל השוקת המרכזית של התאים ולדגור על טמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 15 דקות לפני תום תקופת הדגירה, להכין פתרון Matrigel (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פולי-L-ליזין, לשטוף את השקתות המרכזיות עם 1 מיליליטר מי autoclaved, ו250-300 μl פיפטה של ​​פתרון Matrigel אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון Matrigel ולשטוף בעדינות את השקתות המרכזיות עם 1-2 מ&quot;ל של SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות ולהעביר את תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר פיפטה 3-4 מתרבות neurosphere המכילה לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ ולהעביר את צלחת פטרי לבמה של המיקרוסקופ הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במטרת צפייה של 5x, השתמש P10 פיפטה להעביר 5-8 neurospheres השלם (עד 4 בכל פעם) אל השוקת המרכזית של כל אחד galvanotaxisתא ללא dissociating, ולהפיץ את neurospheres סביב השוקת המרכזית בזהירות מבלי לשבש את מצע Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150-200 μl נוסף של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% חממת humidified ל17-20 שעות (אם הניתוח עבר התמיינות NPCs) כדי לאפשר neurospheres לדבוק במצע Matrigel ולנתק לתאים בודדים, כפי שמוצג באיור 1 . אם ניתוח NPCs בדיל, תקופת הדגירה צריכה להיות מורחבת ל69-72 שעות כדי לאפשר ההתמיינות של התאים. </li></ol> 3. חי הדמית תא זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר למערכת הדמית התא החייה לאזן על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 למינימום של 30 דקות לפני התחלת הקלטת זמן לשגות% 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 12 סנטימטר של 1 מ&quot;מ קוטר חוט כסף, סלילם מקצה אחד, ולמקם אותם באקונומיקה ביץ ל20 דקות כדי ליצור אלקטרודות Ag / AgCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה ובחר שחדר ישמש לניתוח הגירת הדמיה חי תאים בהתבסס על הקריטריונים הבאים: א) את neurospheres צריכה להיות כמעט ניתק לחלוטין לתאים בודדים וii) התאים אמורים להחזיק מורפולוגיות עגולות עם מעט-to-אין תהליכים המשתרעות מגופי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis נבחר לתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, יחד עם כיכר לא נפרד. תלוש 1 מכסה זכוכית וגריז ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכיסוי להחליק ראשון עם אתנול 70%, ולאחר מכן במי autoclaved, ולהחיל רצועת גריז ואקום בשני קצוות מקבילים של תלוש הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תקשורת התרבות מהשוקת המרכזית של החדר, ואז למקם את תגית הכיסוי (גריז בצד פונה כלפי מטה) במהירות על התא כזה ששאר רצועות השומן על שתי רצועות זכוכית המלבניות המקבילות, ביעילות יצירת גגלתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​טרי EFH-SFM או FBS-SFM לתוך השוקת המרכזית באמצעות פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לברכות של מדיה תרבות בכל קצה של השוקת המרכזית, כפי שמוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 15 סנטימטרים של צינורות PVC, ולהשתמש במזרק סמ&quot;ק 10 עם מחט מד 18 להזריק בזהירות פתרון agarose לתוך הצינור, הבטחה ללא בועות נוצרות בצינורות, ולאפשר לג&#39;ל לביסוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis למערכת הדמית התא החייה, יחד עם agarose ג&#39;ל צינורות, Ag / AgCl אלקטרודות, וזוג 60 מנות מ&quot;מ פטרי ריקות שתשמשנה כתרבות תקשורת והמאגרים יכילו Ag / AgCl אלקטרודות. אפשר הקאמרי galvanotaxis לנוח בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 סביבה ל20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את המכסים של 2 צלחות פטרי הריקות והמכסה של צלחת פטרי של galvanotaxis הקאמרי על ידי קידוח חורהאליהם עם כלי Dremel או דומה כפי שמוצג באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1-1.5 מ&quot;ל של EFH-SFM או FBS-SFM על שני צדי התעלה המרכזית, ו7-8 מ&quot;ל של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מקום פטרי צלחת אחת בכל צד של שוקת של הקאמריים galvanotaxis המרכזית ומקום אלקטרודה אחת Ag / AgCl לכל מנה. לגשר על הפער בין הקאמרי galvanotaxis וצלחות פטרי להקים המשכיות חשמלית עם גשרי agarose ג&#39;ל, כפי שמוצג באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את האלקטרודות Ag / AgCl לאספקת כוח חיצונית, עם מד זרם בסדרה למדידת זרם חשמלי, ולהפעיל את אספקת החשמל. השתמש ולטמטר למדוד את עוצמתו של השדה החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית, ולהתאים את הפלט של אספקת החשמל עד לעוצמת השדה החשמלית הרצויה מושגת (המבחנים שבוצעו במעבדה זו לנצל את כוח dcEF של 250 mV / מ&quot;מ עם זרם חשמלי בין 1 ל 1.5 mA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initiaטה מודול זמן לשגות במערכת הדמית התא החייה, ולאפשר את הניסוי לרוץ לסכום הרצוי של זמן. לאחר השלים הבדיקה, לתקן את התאים בparaformaldehyde 4% לניתוח immunostaining סטנדרטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential.">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo.">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo.">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential,+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics.">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li><li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields.">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li><li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent.">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li><li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem/Progenitor+Cell+Migration.">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li><li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li><li>Huang, C. -. W., Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Young, T. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip.">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li><li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells.">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li><li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields.">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li><li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Cell+Behavior+Electrically:+Current+Views+and+Future+Potential.">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li><li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations.">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li><li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Subependymal+Neural+Precursors,+but+Not+Differentiated+Cells,+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields.">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808 (2011).</li><li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson's+Disease.">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li><li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory.">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים 7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO 2 לmicrofabrication של השוקת המרכזית 10,11. טכניקות מסוימות עשויות ל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td height="44"> שמו של פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> בידוד תא מבשר עצבי </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S5886 </td><td> 11.688 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 7.456 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> M2393 </td><td> 20.33 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 155 המ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td> 1.302 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> גלוקוז 0.5m </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td> 9.01 גר &#39;מומס ב100המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.59 גר &#39;מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> סיגמא </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> סיגמא </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> וורטינגטון </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td><td> 23.83 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> לשקם ב1 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> לשקם ב0.5 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> הפארין </td><td> סיגמא </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrin </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> 3188-AT </td><td> 0.1 גרם מומס ל 4 המ&quot;ל DH 2 0 </td></tr><tr><td> פוטרסין </td><td> סיגמא </td><td> P7505 </td><td> ממס 9.61 מ&quot;ג לApo-transferrin כךlution </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I5500 </td><td> להמס 25 מ&quot;ג למ&quot;ל של 0.5 0.1N HCl ולהוסיף עד 3.5 מ&quot;ל של DH 2 0 </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> סיגמא </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> סיגמא </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> כלי נתיחה סטנדרטי </td><td> כלי מדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ נתיחה </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> הכנת Galvanotaxis הקאמרית </td></tr><tr><td> מגלשות כיסוי זכוכית מרובעות </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N חומצה הידרוכלורית </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> גריז ואקום גבוה </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 מנות מ&quot;מ פטרי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> הפשר וaliquot לתוך 150 יחידות μl </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> השתמש אך ורק אם תשכנע את בידול NPC, אחרת להשתמש SFM + תקשורת תרבות EFH כפי שצוינה לעיל </td></tr><tr><td> ספירת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חי הדמית תא זמן לשגות </td></tr><tr><td> חוט כסף </td><td> אלפא Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> החום InactivFBS ated </td><td> סיגמא </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות PVC </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;מזהה x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> מלבין </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 סמ&quot;ק מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מד 18 </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> תרגיל Dremel </td><td> Dremel </td><td> דגם 750 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך מצויד בתא humidified, דגר </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מתכונים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.32 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> קוטר 155 מ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> 16.9 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 1M </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> 0.09256 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 74 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> נוזל השדרתי מלאכותי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> נוזל השדרתי מלאכותי </td><td> 30 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> 40 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> 22.8 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> 5 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> &lt;פתרון חזק&gt; טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> 10 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> פתרון אינהיביטור טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Transferrin, פתרון פוטרסין </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון אינסולין 25 מ&quot;ג </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> 100 &amp; mu, אני </td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> מיקס הורמון (100 המ&quot;ל מוחלט, חנות ב -20 ° C) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 0.75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תמהיל הורמון </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הסרום חינם מדיה EFH-SFM: להוסיף 10 μl של EGF, 10 μl של FGF, ו3.66 μl של הפארין FBS-SFM: להוסיף 0.5 המ&quot;ל FBS <taגבול ble = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3.6 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> aliquot Matrigel Matrigel פתרון צריך להיות ממוקם בקופסא הקרח ואפשר להפשיר לאט במשך 4-5 שעות כדי ליצור נוזל צמיג לפני הערבוב עם SFM. זה יבטיח את היווצרות שכבה חלקה של מצע Matrigel. אם לא הופשר לאט, המצע וכתוצאה יכיל גושי Matrigel, אולי מעכב את נדידת תאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> 300 מ&quot;ג ב10 המ&quot;ל DDH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS המומת חום </td><td> 8 מ&quot;ל 2 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> Matrigelפתרון מערבב 8 מ&quot;ל של SFM עם FBS המומת חום המ&quot;ל 2 בצינור 15 סמ&quot;ק בז. המיקס agarose עם 10 המ&quot;ל DDH 2 0 בבקבוק Erlenmeyer, וחום במיקרוגל למשך 30 שניות במרווחים 10-sec, הבטחה להסרת פתרון מהמיקרוגל אחרי כל מרווח 10-שניות וביסודיות לערבב. בעקבות התקופה האחרונה, 10-שניות במיקרוגל, לערבב עם פתרון agarose / פתרון SFM FBS וחנות ב° C 57 אמבט מים. </td></tr></tbody></table>

a galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field

הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה - תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים 1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של 2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.

ניתוח kinematic מגלה כי בנוכחות dcEF 250 mV / מ&quot;מ, NPCs עבר התמיינות תערוכת galvanotaxis ביים והמהיר ביותר לכיוון הקתודה (האיור 5A, סרט 1). בהעדר dcEF, תנועה אקראית של התאים הוא ציין (5B איור, סרט 2). בשדה הכח הזה,&gt; 98% מNPCs עבר התמיינות להגר ל6-8 השעות כל שהם צלמו, ומאחר שתאים מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field at JoVE.com

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Views.  University of Toronto. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Video: A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Bioengineering

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Biology

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video