עבודה זו מומנה על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (מענק # 249669, ו# 482986) ולב ושבץ קרן של קנדה (מענק # 485508). המחברים מודים יוסוף אל האייק וואן ד&quot;ר צ&#39;י על סיועם בפיתוח פרוטוקולי הניסוי.

כל ההליכים כרוכים בטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טורונטו ועדת טיפול בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות (פרוטוקול לא. 20009387). השיטות הבאות יש לבצע באמצעות כלים וטכניקות סטריליות, במכסת מנוע זרימה למינרית היכן שאפשר. בטקסט הפרוטוקול להלן, הביטוי &quot;EFH-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת עם גורם צמיחה אפידרמיס, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והפרין. EFH-SFM משמש כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs עבר התמיינות בגלל mitogens אלה לשמור NPCs ב4 המדינה המובחנות שלהם. כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs המושרה להתמיין לסוגי תאים בוגרים, &quot;FBS-SFM&quot; מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת סרום שור עוברי 1%. FBS מקדם את הבידול של NPCs לפנוטיפים בשלים עצביים 5. 1. בידוד ותרבות של מבשרים עצביים (לאשמוצג בסרטון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש CD1 עכבר (6-8 שבועות) עם isofluorane והקרבה באמצעות פריקת צוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את הראש באתנול 70% ולערוף את החיה במספריים חדים נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את הראש עם מלקחיים כירורגיים, הסר את העור על פני שטח הגבו לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל ולא. 11 להב, להבקיע את הגולגולת בסינוס המצח לאורך ציר mediolateral, וגם לאורך תפר sagittal בכיוון rostrocaudal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את העצמות הקודקודית מהראש ללא. 7 מלקחיים מעוגלים, נזהרים שלא לנקב את רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מרית דקה מתחת למוח מתחיל מתחת למוח הקטן והתקדם לעבר נורות חוש הריח. בעוד מחזיק את הגולגולת במקום עם מלקחיים, משוך בעדינות את המוח מהגולגולת ולמקם אותו באופן מיידי בנוזל השדרתי מלאכותי קר כקרח (ראה מתכונים בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ נתיחה, באמצעות סטרילימספריים ומלקחי נתיחה יחתכו את המוח במחצית לאורך קו האמצע. סובב אונה כל כך שהמשטח המדיאלי (חתך) פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חצי כדור, ועם פני השטח המדיאלי פונים כלפי מעלה, אתר splenium של כפיס המוח (אזור אחורי של כפיס המוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך מפני השטח של קליפת המוח לsplenium של כפיס המוח לאורך ציר dorsoventral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולף את הקליפה החרוטה כלפי נורת הריח לחשוף את הקירות המדיאלי וצדדיים של חדר הצדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הכדור, כך שהמשטח הגבה פונה כלפי מעלה, ולהשתמש microscissors המעוגל לגזור ולאסוף את הקירות החשופים המדיאלי וצדדיים, שמכילים את האזור שבו periventricular NPCs מתגורר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.8-1.11 לאונה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הרקמות המבודדות ל7 מ&quot;ל של פתרון טריפסין (ראה מתכון בהמשך) בצינור סמ&quot;ק 15, ולמקם את הצינור על כיסא נדנדה ב37 מעלות צלזיוסחממה על 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ורקמות ב2 מ&quot;ל של תמיסת מעכב טריפסין (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות triturate רקמות עם 30-50 פעמי פיפטה קטנות קידוח פסטר בזהירות כדי להימנע מבועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend וב1-2 מ&quot;ל של SFM (ראה מתכון בהמשך) על ידי triturating הגלולה 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב1500 סל&quot;ד ל3 דקות, לשאוב 1 מיליליטר supernatant ו resuspend בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירה לחיות צפיפות תאים עם haemocytometer וצלחת התאים בבקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים לμl בSFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשה התרבות לצמוח במשך 7 ימים ללא הפרעה להניב neurospheres העיקרי צף מורכב מNPCs. </li></ol> 2. הכנת Galvanotaxis הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זכוכית מרובעת 3 לא. 1 תלושי כיסוי (22 x 22 x 0.17 מ&quot;מ) אניבקבוק na של 6N חומצה הידרוכלורית בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, השתמשו יהלום קצה של כוס מחתך לחתוך 6 רצועות מלבניות (22 X 5 X 0.17 מ&quot;מ) של זכוכית מלא מרובע. 1 תלושי עטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התלושים המרובעים חומצה השטופות וחוטרים מלבניים למכסת מנוע זרימה למינרית. שוטף את הרצועות הראשונות עם אתנול 70% המלבניות ומרובעות, עם מי autoclaved תרבות כיתת רקמות, ולאפשר לו להתייבש על קים נגב (על סטריליות הוסיפה, הזכוכית ניתן לאפשר לו להתייבש באוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום להיקף של פני שטח באחת שקופיות הזכוכית המרובעות, ולאטום אותם לבסיס של 60 צלחות פטרי פלסטיק מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחת ואקום לאורך הציר הארוך של משטח אחד מרצועות הזכוכית המלבניות, ולאטום אותם לקצוות שונים של שקופיות הזכוכית המרובעות (כזה שהם מקבילים זה לזה) על מנת ליצור שוקת מרכזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV-לעקר את התאים לפחות 15 דקות במכסת מנוע הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250-300 μl פיפטה של ​​פולי-L-lysiנה אל השוקת המרכזית של התאים ולדגור על טמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 15 דקות לפני תום תקופת הדגירה, להכין פתרון Matrigel (ראה מתכון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פולי-L-ליזין, לשטוף את השקתות המרכזיות עם 1 מיליליטר מי autoclaved, ו250-300 μl פיפטה של ​​פתרון Matrigel אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון Matrigel ולשטוף בעדינות את השקתות המרכזיות עם 1-2 מ&quot;ל של SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות ולהעביר את תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר פיפטה 3-4 מתרבות neurosphere המכילה לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ ולהעביר את צלחת פטרי לבמה של המיקרוסקופ הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במטרת צפייה של 5x, השתמש P10 פיפטה להעביר 5-8 neurospheres השלם (עד 4 בכל פעם) אל השוקת המרכזית של כל אחד galvanotaxisתא ללא dissociating, ולהפיץ את neurospheres סביב השוקת המרכזית בזהירות מבלי לשבש את מצע Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150-200 μl נוסף של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% חממת humidified ל17-20 שעות (אם הניתוח עבר התמיינות NPCs) כדי לאפשר neurospheres לדבוק במצע Matrigel ולנתק לתאים בודדים, כפי שמוצג באיור 1 . אם ניתוח NPCs בדיל, תקופת הדגירה צריכה להיות מורחבת ל69-72 שעות כדי לאפשר ההתמיינות של התאים. </li></ol> 3. חי הדמית תא זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר למערכת הדמית התא החייה לאזן על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 למינימום של 30 דקות לפני התחלת הקלטת זמן לשגות% 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 12 סנטימטר של 1 מ&quot;מ קוטר חוט כסף, סלילם מקצה אחד, ולמקם אותם באקונומיקה ביץ ל20 דקות כדי ליצור אלקטרודות Ag / AgCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה ובחר שחדר ישמש לניתוח הגירת הדמיה חי תאים בהתבסס על הקריטריונים הבאים: א) את neurospheres צריכה להיות כמעט ניתק לחלוטין לתאים בודדים וii) התאים אמורים להחזיק מורפולוגיות עגולות עם מעט-to-אין תהליכים המשתרעות מגופי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis נבחר לתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, יחד עם כיכר לא נפרד. תלוש 1 מכסה זכוכית וגריז ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכיסוי להחליק ראשון עם אתנול 70%, ולאחר מכן במי autoclaved, ולהחיל רצועת גריז ואקום בשני קצוות מקבילים של תלוש הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תקשורת התרבות מהשוקת המרכזית של החדר, ואז למקם את תגית הכיסוי (גריז בצד פונה כלפי מטה) במהירות על התא כזה ששאר רצועות השומן על שתי רצועות זכוכית המלבניות המקבילות, ביעילות יצירת גגלתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פיפטה של ​​טרי EFH-SFM או FBS-SFM לתוך השוקת המרכזית באמצעות פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לברכות של מדיה תרבות בכל קצה של השוקת המרכזית, כפי שמוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך שתי חתיכות 15 סנטימטרים של צינורות PVC, ולהשתמש במזרק סמ&quot;ק 10 עם מחט מד 18 להזריק בזהירות פתרון agarose לתוך הצינור, הבטחה ללא בועות נוצרות בצינורות, ולאפשר לג&#39;ל לביסוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה הקאמרית galvanotaxis למערכת הדמית התא החייה, יחד עם agarose ג&#39;ל צינורות, Ag / AgCl אלקטרודות, וזוג 60 מנות מ&quot;מ פטרי ריקות שתשמשנה כתרבות תקשורת והמאגרים יכילו Ag / AgCl אלקטרודות. אפשר הקאמרי galvanotaxis לנוח בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 סביבה ל20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את המכסים של 2 צלחות פטרי הריקות והמכסה של צלחת פטרי של galvanotaxis הקאמרי על ידי קידוח חורהאליהם עם כלי Dremel או דומה כפי שמוצג באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1-1.5 מ&quot;ל של EFH-SFM או FBS-SFM על שני צדי התעלה המרכזית, ו7-8 מ&quot;ל של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מקום פטרי צלחת אחת בכל צד של שוקת של הקאמריים galvanotaxis המרכזית ומקום אלקטרודה אחת Ag / AgCl לכל מנה. לגשר על הפער בין הקאמרי galvanotaxis וצלחות פטרי להקים המשכיות חשמלית עם גשרי agarose ג&#39;ל, כפי שמוצג באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את האלקטרודות Ag / AgCl לאספקת כוח חיצונית, עם מד זרם בסדרה למדידת זרם חשמלי, ולהפעיל את אספקת החשמל. השתמש ולטמטר למדוד את עוצמתו של השדה החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית, ולהתאים את הפלט של אספקת החשמל עד לעוצמת השדה החשמלית הרצויה מושגת (המבחנים שבוצעו במעבדה זו לנצל את כוח dcEF של 250 mV / מ&quot;מ עם זרם חשמלי בין 1 ל 1.5 mA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initiaטה מודול זמן לשגות במערכת הדמית התא החייה, ולאפשר את הניסוי לרוץ לסכום הרצוי של זמן. לאחר השלים הבדיקה, לתקן את התאים בparaformaldehyde 4% לניתוח immunostaining סטנדרטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential.">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo.">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo.">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential,+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics.">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li><li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields.">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li><li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent.">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li><li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem/Progenitor+Cell+Migration.">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li><li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li><li>Huang, C. -. W., Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Young, T. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip.">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li><li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells.">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li><li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields.">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li><li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Cell+Behavior+Electrically:+Current+Views+and+Future+Potential.">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li><li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations.">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li><li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Subependymal+Neural+Precursors,+but+Not+Differentiated+Cells,+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields.">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808 (2011).</li><li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson's+Disease.">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li><li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory.">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים 7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO 2 לmicrofabrication של השוקת המרכזית 10,11. טכניקות מסוימות עשויות ל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td height="44"> שמו של פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> בידוד תא מבשר עצבי </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S5886 </td><td> 11.688 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 7.456 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> M2393 </td><td> 20.33 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 155 המ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td> 1.302 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> גלוקוז 0.5m </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td> 9.01 גר &#39;מומס ב100המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.59 גר &#39;מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> סיגמא </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> סיגמא </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> וורטינגטון </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td><td> 23.83 גרם מומס 100 המ&quot;ל DH 2 O </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> לשקם ב1 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> לשקם ב0.5 מ&quot;ל של תערובת הורמון וaliquot לתוך 20 יחידות μl. </td></tr><tr><td> הפארין </td><td> סיגמא </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrin </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> 3188-AT </td><td> 0.1 גרם מומס ל 4 המ&quot;ל DH 2 0 </td></tr><tr><td> פוטרסין </td><td> סיגמא </td><td> P7505 </td><td> ממס 9.61 מ&quot;ג לApo-transferrin כךlution </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I5500 </td><td> להמס 25 מ&quot;ג למ&quot;ל של 0.5 0.1N HCl ולהוסיף עד 3.5 מ&quot;ל של DH 2 0 </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> סיגמא </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> סיגמא </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> כלי נתיחה סטנדרטי </td><td> כלי מדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ נתיחה </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> הכנת Galvanotaxis הקאמרית </td></tr><tr><td> מגלשות כיסוי זכוכית מרובעות </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N חומצה הידרוכלורית </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> גריז ואקום גבוה </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 מנות מ&quot;מ פטרי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> הפשר וaliquot לתוך 150 יחידות μl </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> השתמש אך ורק אם תשכנע את בידול NPC, אחרת להשתמש SFM + תקשורת תרבות EFH כפי שצוינה לעיל </td></tr><tr><td> ספירת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חי הדמית תא זמן לשגות </td></tr><tr><td> חוט כסף </td><td> אלפא Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> החום InactivFBS ated </td><td> סיגמא </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות PVC </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;מזהה x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> מלבין </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 סמ&quot;ק מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מד 18 </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> תרגיל Dremel </td><td> Dremel </td><td> דגם 750 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך מצויד בתא humidified, דגר </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מתכונים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.32 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> קוטר 155 מ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> 16.9 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 1M </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 108 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> 0.09256 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 74 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> נוזל השדרתי מלאכותי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> נוזל השדרתי מלאכותי </td><td> 30 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין לבלב שור </td><td> 40 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> כבשי אשכי hyaluronidase </td><td> 22.8 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> חומצת Kynurenic </td><td> 5 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> &lt;פתרון חזק&gt; טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מעכב טריפסין Ovomucoid </td><td> 10 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> פתרון אינהיביטור טריפסין <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Transferrin, פתרון פוטרסין </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון אינסולין 25 מ&quot;ג </td><td> 4 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סלניום </td><td> 100 &amp; mu, אני </td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> מיקס הורמון (100 המ&quot;ל מוחלט, חנות ב -20 ° C) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> מי Autoclaved </td><td> 37.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז 30% </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 7.5% 3 NaHCO </td><td> 0.75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0.25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תמהיל הורמון </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הסרום חינם מדיה EFH-SFM: להוסיף 10 μl של EGF, 10 μl של FGF, ו3.66 μl של הפארין FBS-SFM: להוסיף 0.5 המ&quot;ל FBS <taגבול ble = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3.6 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> aliquot Matrigel Matrigel פתרון צריך להיות ממוקם בקופסא הקרח ואפשר להפשיר לאט במשך 4-5 שעות כדי ליצור נוזל צמיג לפני הערבוב עם SFM. זה יבטיח את היווצרות שכבה חלקה של מצע Matrigel. אם לא הופשר לאט, המצע וכתוצאה יכיל גושי Matrigel, אולי מעכב את נדידת תאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> נפח או מסה </td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> 300 מ&quot;ג ב10 המ&quot;ל DDH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS המומת חום </td><td> 8 מ&quot;ל 2 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> Matrigelפתרון מערבב 8 מ&quot;ל של SFM עם FBS המומת חום המ&quot;ל 2 בצינור 15 סמ&quot;ק בז. המיקס agarose עם 10 המ&quot;ל DDH 2 0 בבקבוק Erlenmeyer, וחום במיקרוגל למשך 30 שניות במרווחים 10-sec, הבטחה להסרת פתרון מהמיקרוגל אחרי כל מרווח 10-שניות וביסודיות לערבב. בעקבות התקופה האחרונה, 10-שניות במיקרוגל, לערבב עם פתרון agarose / פתרון SFM FBS וחנות ב° C 57 אמבט מים. </td></tr></tbody></table>

a galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field

הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה - תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים 1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של 2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.

ניתוח kinematic מגלה כי בנוכחות dcEF 250 mV / מ&quot;מ, NPCs עבר התמיינות תערוכת galvanotaxis ביים והמהיר ביותר לכיוון הקתודה (האיור 5A, סרט 1). בהעדר dcEF, תנועה אקראית של התאים הוא ציין (5B איור, סרט 2). בשדה הכח הזה,&gt; 98% מNPCs עבר התמיינות להגר ל6-8 השעות כל שהם צלמו, ומאחר שתאים מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field at JoVE.com

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Views.  University of Toronto. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Video: A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...