גנגליון העוף, הוא מבנה מקומי בחלק האחורי של העין, סמוך לעצב הראייה בסקור הצ'רויד. והנוירונים גנגליון ciliary, שייכים למערכת העצבים parasympathetic, והם נוירונים כולין, ולכן הם יכולים להקים סינפסות כולין. הגנגליון הסיליארי מורכב מאוכלוסייה עצומה של נוירונים סילאריים ותוירונים choroidal, כי הם מבנית ותפקודית ברורה.
אז הנוירונים הסיליאריים הפנימיים הפנימיים של השרירים האינטר עיניים, ותאי עצב choroidal innervates שריר מצב הרוח בעין. ובימים הראשונים בתרבות, תאי העצב של הגנגליון הסיליארי מציגים מורפולוגיה רב-קוטבית, ולאחר מכן, הם מתחילים לעבור למצב חד קוטבי, שבו אחד הנוריטים משתרע ויוצר את האקסון. אחד המחקרים הנפוצים ביותר באמצעות נוירונים גנגליון ciliary, הוא מחקר של הסינפסות neuromuscular, שהם סינפסות שימוש, ואת השימוש של נוירונים גנגליון ciliary הפך חלופה טובה, בהשוואה למודלים קודמים, בשל העובדה כי האוכלוסייה העצבית המתקבלת, הוא הומוגני במובן זה, כל הנוירונים הם שימוש, ולכן הם יכולים להקים סינפסות פונקציונליות עם תאים וזה לא קורה כאשר אנו עובדים עם אוכלוסייה עצבית, זה לא לגמרי כולין.
הזיהוי והניתוס של הגנגליון הסיליארי יכולים להיות מאתגרים למדי עבור מישהו שעושה את זה בפעם הראשונה, אז כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, לזיהוי ותניתחו המתאימים של הגנגליון הסיליארי, כמו גם את ההנחיות לתרבות מוצלחת של נוירונים אלה. להכנת כיסויים, תצטרך, 13 מילימטר זכוכית מכסה, מיכל עמיד בחומצה, 65% חומצה חנקתית, פינצטה, מים מילי-Q, 75% אתנול שייקר מסלולית. הכנת coverslips עבור תרבויות ראשוניות, צריך להיעשות יומיים לפני ההליך.
מניחים את המספר הרצוי של כיסויי זכוכית, בתוך מיכל עמיד בחומצה, ומוסיפים 65% חומצה חנקתית, עד שכל הכיסויים מכוסים. מניחים את המיכל בשייקר מסלולי, ו דגירה לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה. למחרת, להסיר בזהירות את החומצה החנקתית, ולככב לשימוש חוזר.
לשטוף את הכיסויים, להוסיף מים מילי-Q למיכל. שוב, הצבת תסיסה במשך 30 דקות, להשליך את פתרון הכביסה, ולחזור על תהליך זה חמש פעמים. שוטפים את הכיסויים פעמיים באמצעות 75% אתנול.
בזהירות להפריד ולמקום כיסויים בודדים בארון מתכת, מכוסה רדיד אלומיניום, דגירה ב 50 מעלות, במשך 10 עד 15 דקות, או עד שהם יבשים לחלוטין. יש לעקר את הכיסויים באור ה-UV למשך 10 עד 15 דקות. עבור ציפוי coverslips, תצטרך, כיסויי זכוכית סטריליים, צלחת 24-Well, פינצטה סטרילית, 0.1 מיליגרם לכל פתרון PDL מיליליטר, מים סטריליים, 10 מיקרוגרם לכל פתרון למינין מיליליטר, מדיום נוירובסאלי רגיל, ומדיום שלם גנגליון סילארי.
ציפוי של coverslips, צריך להיעשות יום לפני ההליך. באמצעות פינצטה סטרילית, מניחים כיסוי אחד בכל באר של צלחת 24-Well, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פתרון דיאליזה פולי, בריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר, ו דגירה לילה ב 37 מעלות. למחרת, לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם מים סטריליים, להשליך את המים, ולהוסיף 350 microliters של פתרון למינין בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר לכל באר.
מניחים באינקובטור, ב 37 מעלות במשך שעתיים. לאחר זמן זה, ולפני ציפוי התא, להסיר את תטגם למינין, ולשטוף פעמיים עם 300 microliters של מדיום נוירובסאלי רגיל. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מדיום שלם, והצבו באינקובטור, ב-37 מעלות וב-5%CO2, עד שתהיו מוכנים לצלחת תאים.
עבור הליך הניתוח, תצטרך, ביצי עוף ביום עוברי שבע, 75% אתנול, מלקפלי ניתוח מספר 545 ומספר 55, מספריים, כפית, מנות פטרי ניתוח עם תחתית שחורה ותווית HBSS קר כקרח. הקפד לעקר את כל כלי הניתוח ב 75%אתנול. יש לאחסן ביצים ב-16 מעלות לפני הדגירה באינקובטור ביצים, ב-37.7 מעלות, במשך שבעה ימים, או בשלב עוברי רצוי אחר.
ביום ההליך, להסיר את הביצים מן החממה, לרסס את הביצים עם 75% אתנול. קבל את החלק העליון של הביצה באמצעות מספריים, בזהירות להוציא את אמברוי באמצעות כפית. מניחים את העובר, בצלחת פטרי עם פתרון HBSS קר כקרח, ומיד להפריד את הראש מהגוף, על ידי חיתוך באזור הצוואר.
לאחר מכן להעביר את הראש לצלחת פטרי חדשה עם פתרון HBSS קר קרח נקי. ברגע שהעובר מוסר מהביצה, הוא מסוגל לייצר פרוטאזות האחראיות למוות של תאים. לכן חשוב להפריד את הראש מהגוף מהר ככל האפשר, ברגע שהעובר נמצא מחוץ לביצה כדי למזער את המוות של התא.
חשוב מאוד גם לשמור על ראש העובר בתסכול HBSS קר כקרח. החזק את ראש העובר למעלה, ותקן אותו במקרה של הגוזל, ולאחר מכן להתחיל להסיר את השכבה הדקה של העור סביב העין. בזהירות, להסיר את העין על ידי בעדינות סיבוב אותו מן הראש.
ובזמן שהפרדת העין מראש הגוזל, שימו לב שעצב הראייה נקטע. לפקוח את העין עם הצד האחורי למעלה, ולהבחין גנגליון ciliary, סמוך עצב הראייה חיישן סדק choroid. העצב הקדם-גני עדיין עשוי להיות מחובר לגנגסטר הסיליארי, מה שמקל על זיהויו.
לנתח את הגנגליון ciliary, מכל עין, ולנקות אותו היטב על ידי הסרת הרקמה העודפת. מעבירים את הגנגליה המנותחת לצלחת פטרי עם תסכול HBSS על קרח. על מנת לקבל תשואה של כמיליון תאים למיליליטר, אתה צריך לנתח סביב 70 גרנגליה, וגם לזכור כי אוכלוסיית התאים שהושגה, יש תאים שאינם עצביים גם כן, ולכן על מנת להקטין את מספר תאים שאינם עצביים, וגם כדי להגדיל את הטוהר של האוכלוסייה הנוירנית שלך, חשוב לנקות את הגרופיות ciliary טוב מאוד הסרת כל הרקמה העודפת.
עבור דיסוציאציה של רקמות, תצטרך, צלחת 24-Well, 0.1% תסיעה פתרון, מדיום ג'נרי לא שלם, פיפטה מאפה זכוכית מלוטש אש, ו פיפטה פסטור פלסטיק. הרטב מראש פיפטה פסטר פלסטיק סטרילי, ולאסוף את כל הגרופליה ciliary לצינור 15 ML, וצנטריפוגה במשך שתי דקות ב 200 Gs.Carefully, להסיר את כל מדיום HBSS, באמצעות פיפטה פסטר כדי להסיר נפח גדול יותר, ולאחר מכן, כאשר אתה קרוב יותר גלולה, להשתמש פיפטה מיקרו. מוסיפים מיליליטר אחד של תוסף 0.1% נסיעה, ו דגירה במשך 20 דקות, ב 37 מעלות באמבט מים.
צנטריפוגה במשך שתי דקות, ב 200 Gs.מיד, להסיר את פתרון tripsin, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם. הנסיוב במדיום לא שלם, יפסיק מיד את הפעילות של טריפסין. צנטריפוגה במשך שתי דקות, ב 200 Gs, ולהסיר את כל בינוני.
הוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום מלא, ולהתחיל את דיסוציאציה רקמה באמצעות micropipette P1000. התחל על ידי צינור למעלה ולמטה, 10 עד 15 פעמים, ולאחר מכן, לעבור פיפטה פסטור זכוכית מלוטש אש, ושוב, פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים. ההשעיה התא צריך להיות מטושטש, כסימן של דיסוציאציה מוצלחת של רקמות.
הנפח הדרוש כדי לנתק תאים תלוי במספר של גנגליה ciliary שהושגו זה, ואת גודל גלולה. כאשר צינור למעלה ולמטה כדי לנטרל רקמה, חשוב להימנע בועות אוויר היווצרות, זה יהיה למזער את אובדן התא. לאחר שימוש חוזר בתאים, אתה יכול להשאיר את ההשעיה התא על קרח עד ציפוי.
קבע את הצפיפות התאית באמצעות פתרון כחול טריפאן, בתא הנויבאואר. זה השעיית תא עופרת במדיום מלא, עם 5FTU, בצפיפות הרצויה צלחת 500 microliters של תאים ל הבאר. דגירה תאים ב 37 מעלות ו 5%CO2.
הקפד לבדוק את התרבות שלנו כל יום ולעקוב אחר התפתחות התאים. תאי גרפיליה Ciliary לפתח די מהר במבחנה, ואחרי יום אחד, אנחנו כבר יכולים לראות כמה neurites המשתרעים מגוף התא. לאחר שבעה עד שמונה ימים במבחנה, הרשת העצבית מבוססת היטב, ואת התאים ניתן לשמור לפחות 15 ימים.
אחרי יום אחד במבחנה, נוירונים גנגליון סיליארי להראות מיתולוגיה רב קוטבית. עם זאת, הרחבת neurites מתרחשת במהירות הנוירונים הוקמה בעליל את הרשת העצבית, כבר לאחר 24 שעות. במבחנה, נוירונים גנגליון ciliary אחראים הפנימיות של השריר בעין.
וכך, תרבויות עצביות אלה, מתאימות מאוד לחקר הסינפסות הנוירומוסקולריות. לשם כך, נוירונים גנגליון ciliary יכול להיות מצופה על גבי תאי שריר. כאן, אנו מראים תרבות מוצלחת, של העין vitreous, נוירונים CG, על גבי העין V7 אפרוח נוירונים שרירים pectral.
סמן קדחת סינפטית, SV2, להראות סינפסות פעילות שנקבעו בין אקסונים נוירונים CG, ואת סיבי השריר, מזוהה בקלות על ידי גרעינים מרובים. נוירונים גנגליון Ciliary שהושגו עם פרוטוקול זה מתאימים immunocytochemistry, אלקטרופיזיולוגיה, ומסות הישרדות בין היתר. פרוטוקול ניתוח זה, מניב מספר נמוך מאוד של נוירונים, אבל אם נעשה כראוי, יספק את האוכלוסייה הטהורה של נוירונים שימוש.
חשוב מאוד כי כל גנגסטר מנוקה היטב ואת הרקמה העודפת מוסרת. לשם כך, יש להשתמש במכשירים באיכות גבוהה, כך שניתן להסיר רקמה זו על מנת למנוע זיהום על ידי תאים שאינם עצביים. גילו של העובר יקבע את הצלחת הפרוטוקול שלנו.
באופן אידיאלי, הניתוח צריך להתבצע בין E7 ו E8. נקודת זמן זו חשובה מאוד, כי בשלב זה, המוות התא ההתפתחותי המתרחשת בדרך כלל במבחנה עדיין לא התרחש. על מנת למזער את הזיהום של תאים אלה שאינם עצביים, אנו משתמשים 5FTU בתקשורת התרבות כדי למזער את הצמיחה של תאים גליה fibroblasts. מודל תאים זה מספק חלופה מצוינת לחקר מחלת הנירומוסקלר שלך.
בהתבסס על פרוטוקול זה, ניתן לטפל בשאלות מדעיות נוספות, לדוגמה, כיצד לוקליזציה של תאי משנה של קרבונטים ספציפיים וחלבונים ספציפיים מווסתת היווצרות ותפקוד סינפסה. בנוסף, זה די קל להקים תרבויות שריר העצבים כדי לענות על שאלות נוספות כמו המחקר של מחלות neuromuscular.
