Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Riepilogo

Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell'architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

Abstract

Sempre più spesso, fantasia ambienti colture cellulari stanno diventando una tecnica rilevante per lo studio caratteristiche cellulari, e molti ricercatori credono nella necessità di ambienti 3D per rappresentare gli esperimenti in vitro che meglio imitare in qualità vivo ^1-3. Gli studi in campi come la ricerca sul cancro ^4, ingegneria neurale ^5, fisiologia cardiaca ⁶ e cellula-matrice interazione ^7,8 hanno mostrato il comportamento delle cellule differisce in modo sostanziale tra le colture monostrato tradizionali e costrutti 3D.

Idrogel sono utilizzati come ambienti 3D a causa della loro varietà, versatilità e capacità di adattare la composizione molecolare attraverso funzionalizzazione ^9-12. Esistono numerose tecniche per la creazione di costrutti come cellule matrici di supporto, tra cui electrospinning ^13, francobolli elastomero ^14, stampa a getto d'inchiostro ^15, photopatterning additivo ^16, fotomaschera statico proiezione-litografia ^17, e microstereolithography maschera dinamico ^18. Purtroppo, questi metodi comportano fasi di produzione multiple e / o attrezzature non facilmente adattabile alle celle convenzionali e metodi di coltura di tessuti. La tecnica impiegata in questo protocollo si adatta ultimi due metodi, utilizzando un dispositivo digitale microspecchi (DMD) per creare fotomaschere dinamico per reticolazione geometricamente specifici poli-(glicole etilenico) (PEG) idrogel, indotta attraverso polimerizzazione UV iniziato radicali liberi. La risultante "2,5 D" strutture offrono un ambiente limitato 3D per la crescita neuronale. Ci avvaliamo di un sistema dual-idrogel approccio, in cui PEG funge da cellula-restrittivo struttura regione fornisce a un altro modo informe, ma cellule permissive auto-assemblaggio gel a base di entrambi i Puramatrix o agarosio. Il processo è veloce semplice fabbricazione passo che è altamente riproducibile e facilmente adattati per essere utilizzati con i metodi tradizionali di coltura cellulare e substrati.

Espianti di tessuto intero, come ad esempio embrionale gangli spinali (DRG), possono essere incorporati in costrutti idrogel doppio per le prove sperimentali come crescita dei neuriti. Inoltre, le cellule possono essere dissociate incapsulato nel idrogel photocrosslinkable o auto polimerizzazione, o selettivamente aderito alla membrana permeabile supporto utilizzando cellule restrittive photopatterning. Utilizzando la DMD, abbiamo creato idrogel costruisce fino a ~ 1 mm di spessore, ma a film sottile (<200 micron), le strutture PEG sono stati limitati dalla tempra d'ossigeno della reazione di polimerizzazione radicalica. Successivamente abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza uno strato di olio di sopra del liquido di polimerizzazione che ha permesso sottile polimerizzazione struttura PEG.

In questo protocollo, si descrive la creazione rapida di sistemi di idrogel 3D per la produzione di microfabbricazione di cellule neuronali e colture di tessuti. I costrutti idrogel dual dimostrato nel presente documento rappresentano versatili modelli in vitro che possono rivelarsi utili per gli studi nel campo delle neuroscienze che coinvolgono la sopravvivenza delle cellule, la migrazione e / o la crescita dei neuriti e di orientamento. Inoltre, come il protocollo può funzionare per molti tipi di idrogel e cellule, le potenziali applicazioni sono sia vario e vasto.

Protocollo

1. DMD installazione

1. La scheda DMD, guida di luce UV (con collimatore) e la lente obiettivo 4x sono tutti montati verticalmente su un tavolo isolamento dalle vibrazioni.
2. La guida ai raggi UV deve essere regolata in modo che la luce colpisce l'array specchio con un angolo di 45 ° rispetto al piano degli specchi, e 24 ° sotto il piano degli specchi (Figura 1).
3. La lente obiettivo è montato in modo che la distanza dalla DMD alla lente obiettivo corrisponde alla lunghezza focale associata con la lente.
4. Un microscopio invertito è posto sotto la lente dell'obiettivo, in modo che la luce focalizzata riflessa dalla DMD possono essere visualizzati attraverso il microscopio. La distanza dalla lente obiettivo alla superficie polimerizzazione dovrebbe corrispondere a circa la distanza di lavoro della lente. Il palco sul microscopio può quindi essere usato per regolare questa distanza a fuoco con precisione l'immagine. Questa distanza può variare a seconda della superficie polimerizzazione scelto.

2. Costruisce Hydrogel doppio per Tissue Culture Espianto

A. DRG espianto adesione

1. Rivestire le pareti di 6-cell e inserti rivestiti cultura collagene (Corning) con Rain-X, avendo cura di evitare la membrana stessa. (In alternativa, una penna barriera idrofoba può essere utilizzato.)
2. Inserti idrato durante la notte con 1,5 ml di adesione medio in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2. L'adesione media è di media neurobasal con il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF.
3. Harvest embrionale radice gangli dorsali (DRG) da E-15 cuccioli di ratto. DRG dovrebbe essere placcato sul collagene rivestito da 6 e inserti, ben quattro per inserto.
4. Incubare inserti per 2 ore per consentire DRG adesione alla membrana.

B. Dinamica maschera fotopolimerizzazione

Un dispositivo micromirror digitale (DMD) è una x 1024 768 serie di singoli specchi, simile a quella di televisori a proiezione, che riflette la luce selettivamente in base alla posizione dello specchio. Per i nostri scopi, il DMD viene usato per modello ultravioletti (UV) su idrogel photocrosslinkable, creando geometrie idrogel determinabile in modo semplice e rapido. La figura 1 mostra la configurazione del percorso DMD e raggi UV. Anche se il nostro DMD è una unità autonoma, il dispositivo può essere integrato anche per l'uso con molti microscopi esistenti.

1. Rimuovere tutto il liquido in eccesso da inserire ed aggiungere 500 ml di polimerizzazione medio dentro l'inserto. Medio di polimerizzazione contiene il 10% PEG (MW 1000) e 0,5% Irgacure 2959 sciolto in media neurobasal integrata con 20 mg / ml di NGF e 1% Pen / Strep.
2. Collocare l'inserto sotto il dispositivo DMD su un Rain-X vetrino trattati.
3. Caricare l'immagine appropriata in bianco e nero da utilizzare come "fotomaschera" sul DMD, attraverso l'uso del programma incluso ALP-3 GUI di base. Per i nostri scopi, una forma biforcano è stato scelto per consentire l'attuazione di sistemi di guida dei neuriti.
4. Utilizzando un microscopio invertito per la visualizzazione, allineare il espianti di tessuto con la posizione appropriata sul fotomaschera utilizzando una sorgente di luce visibile riflessa della DMD.
5. Accendere la sorgente di luce visibile per la sorgente di luce UV, e illuminare la soluzione di PEG fino a reticolazione è sufficiente. (Per le condizioni date e 5,0 watt / cm ² incidente sul DMD, reticolazione può essere completato in appena 55 secondi.) Ripetere per tutti i DRG quattro sull'inserto.
6. Lavare ogni inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep.
7. Aggiungere 1,5 ml di crescita medio sotto gli inserti di coltura cellulare, e permette di equilibrare in un incubatore per 30 minuti. Mezzo di crescita e 'di medie neurobasal contenente 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF.

C. idrogel secondaria

Puramatrix

1. Per le applicazioni neuronale, 1% Puramatrix viene diluita secondo le istruzioni del produttore al 0,15% in sterili H ₂ O e integrata con 1 mg / mL laminina solubile.
2. Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dal PEG vuoti, che contengono le espianti DRG, utilizzando un cotton-fioc sterile, Kimwipe, o micropipetta.
3. Puramatrix viene aggiunto alla vuoti PEG con una micropipetta per riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume vuoto, tipicamente ~ 1 ml viene usato per costruire.
4. Puramatrix inizia il processo di auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina fisiologica, cioè il PEG gonfio, ma 1,5 mL di terreno di coltura viene aggiunto sotto l'inserto e messo in incubatrice per un'ora per garantire la gelificazione totale.
5. Inizialmente, Puramatrix è leggermente acido, in modo da cambiare il supporto dopo un'ora per permettere di equilibrare il pH.
6. Cambiamenti media sono necessari circa ogni 48 ore. Fare attenzione che tutti i media èaggiunto sotto l'inserto, per proteggere l'integrità del Puramatrix meccanicamente deboli.

Agarosio

1. Per le applicazioni neuronale, agarosio viene diluita ad una soluzione 1% a mezzo di crescita e posto in un bagno d'acqua a 60 ° C fino a quando l'agarosio si scioglie completamente (~ 1 ora). La soluzione è quindi integrata con 1 mg / mL laminina solubile.
2. Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dalla vuoti PEG.
3. Agarosio viene aggiunto alla vuoti PEG al fine di riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume di vuoto, di solito ~ 1 ml viene usato per costruire.
4. 1,5 mL di terreno di coltura è pre-fresco (8 ° C) in un 6-pozzetti, e gli inserti di agarosio contenente vengono trasferiti ai media refrigerati e mantenuti in frigorifero a 8 ° C per almeno tre minuti per consentire di agarosio gel.
5. Infine, gli inserti sono trasferiti a 1,5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura (37 ° C) e mantenuto in incubatrice a 37 ° C, con cambiamenti supporto richiesto ogni 48 ore.

3. Cellulare dual incapsulamento Hydrogel 3D

Incapsulamento idrogel Dual è appropriata quando si utilizza qualsiasi auto-assemblaggio gel. Il gel photocrosslinkable, in questo caso PEG, funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica della auto-assemblaggio gel, ad esempio Puramatrix o agarosio. Alcuni dei metodi, in particolare il tipo di gel e la scelta di fotomaschera, dipenderà dalla particolare applicazione desiderata.

1. Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per la nostra applicazione, la sopravvivenza cellulare, abbiamo semplicemente scelto una presentazione cilindrica di Puramatrix per aiutare nella stampa delle cellule. Ricercatori che studiano segnalazione cellulare potrebbe essere interessato a una geometria compartimentale per consentire la diffusione di molecole chemiotattici. Inoltre, una rozza approssimazione di un'arteria ha dimostrato di rappresentare possibile applicazione alla ricerca dei vasi sanguigni.
2. Trattare le pareti di un inserto in colture cellulari in poliestere con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito.
3. Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi.
4. Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep.
5. Rimuovere tutti i supporti in eccesso dal PEG vuoti.
6. Spin le cellule alla densità desiderata in un pellet. Bisogna fare attenzione a rimuovere tutti i media dal pellet cellula prima della miscelazione, come Puramatrix inizia auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina. Sospendere le cellule all'interno dello 0,15% Puramatrix diluita in H ₂ O sterile supplementato con 10% di saccarosio.
7. Iniettare il Puramatrix / cellula / saccarosio miscela all'interno vuoti nel PEG.
8. Aggiungere 1,5 mL di terreno di crescita sotto l'inserto, e permettono di gel all'interno dell'incubatore per un'ora.
9. Cambiare i media dopo un'ora, e ~ ogni 48 ore successive.

4. Singola cella incapsulamento Hydrogel 3D

Un incapsulamento idrogel unico potrebbe essere appropriato per ogni situazione in cui le cellule possono essere esaminate all'interno di un idrogel photocrosslinkable.

1. Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per gli studi di sopravvivenza cellulare, abbiamo scelto ancora una volta una maschera di base circolare, per rappresentare un cilindro. Maschere simili a quelli mostrati nel metodo 4 potrebbe nuovamente essere applicata per il campo di ricerca appropriato.
2. Trattare una cella inserire poliestere cultura con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito.
3. Celle in qualsiasi concentrazione desiderata possono essere aggiunti direttamente alla soluzione di PEG al 10%, mescolando bene per assicurare una distribuzione omogenea.
4. Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi.
5. Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep.
6. Riempire con mezzo di crescita sia sotto che sopra l'inserto, cambiando ogni ~ 2 giorni.

5. A film sottile di polimerizzazione Hydrogel

1. Caricare una maschera appropriata sul DMD.
2. Trattare un collagene rivestito cellule inserire poliestere cultura con Rain-X, e il luogo di pioggia-X scivolo rivestito.
3. Aggiungi medio di polimerizzazione sufficiente per coprire solo la parte inferiore dell'inserto (~ 250-300 microlitri per 6-e inserti di lamiera). Consentire ai media di permeare la membrana inserto per 30-45 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere l'eccesso di polimerizzazione medio dal inserto con una micropipetta o Kimwipe. Aggiungere una quantità sufficiente di raggi UV-trasparente di olio per coprire completamente il fondo dell'inserto. Lasciare l'inserto a sedere per 15-30 minuti a temperatura ambiente, il tempo necessario per l'olio per formare uno strato distinto al di sopra della media saturando polimerizzazione della membrana inserimento.
5. Collocare l'inserto e far scorrere sotto la DMD. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV. A causa della sottigliezza dello strato di PEG, reticolazione può essere completato in appena 15 secondi a 5,0 watt / cm ² incidente sulla DMD.
6. Lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. (Se la persistenza di un residuo oleoso è una preoccupazione, un detergente delicato come il Tween 20 (1%) può essere aggiunta al tampone di lavaggio.)
7. Conservare l'inserto in un 6-pozzetti di coltura tissutale. Aggiungi terreno di coltura per cellule in sospensione, nella concentrazione desiderata e pipetta un volume sufficiente di sospensione cellulare dentro l'inserto di coltura cellulare per ottenere la densità cellulare desiderato. Quindi, aggiungere la crescita media abbastanza sotto l'inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare (~ 1,5 ml).
8. Dopo 48 ore sono trascorse, lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep per rimuovere tutte le cellule unadhered. Modificare i media circa una volta ogni 48 ore.

6. Rappresentante Risultati

Esempi di idrogel dual costruisce contenenti espianti DRG sono mostrati nella Figura 2. Si noti che la migrazione cellulare e l'estensione dei neuriti è limitata alla regione cellula permissiva del idrogel doppio costrutto. La Figura 3 mostra le cellule incapsulate dissociato allo stesso modo all'interno del costruisce idrogel duale. A causa della natura dinamica del fotomaschera DMD, la geometria a disposizione per l'incapsulamento è limitata solo dalle dimensioni e la risoluzione delle ottiche. Incapsulamento delle cellule è stato possibile anche all'interno di un idrogel singolo photopolymerizable, PEG, e un vivo / morto test di vitalità è stato effettuato, come evidenziato in Figura 4. Incapsulamento di PEG è inteso solo come esempio, come PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. Pertanto, la vitalità cellulare realizzato nel nostro costruisce PEG è comprensibilmente bassa. Infine, esempi di utilizzo PEG film sottile come uno strato di fantasia restrittive per l'adesione cellulare su inserti colture cellulari sono mostrati in figura 5. Inoltre, esempi di possibili "cattivi" i risultati sono offerti in Figura 6.

I risultati rappresentano solo una piccola frazione dei possibili usi dei metodi sviluppati nel nostro laboratorio. Essi hanno lo scopo di dimostrare l', versatilità e facilità la vitalità del nostro approccio, e potrebbero essere trattati come "prova di principio" per i ricercatori a sviluppare i loro propri adattamenti possibili.

Figura 1. Illustrazione schematica del percorso della luce utilizzata per fotolitografia. Riquadro: La luce UV illumina il DMD con un angolo di 45 ° e 24 ° sotto il piano del vettore specchio.

Figura 2. Crescita e la proliferazione in etichetta DRG contenenti costrutti di idrogel duale. DC) raffigurante immagini polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). Il espianti DRG sono contenuti in Puramatrix e situati nelle regioni circolare del modello, con neuriti crescente verso la biforcazione (s).

Figura 3. Costruisce idrogel doppio contenente cellule marcate con calceina AM, un marker di cellule in vivo, dopo 48 ore in mezzo di crescita. DC) PEG forme diverse, piene di Puramatrix contenenti dissociata neuroni DRG (~ 5x10 ³ celle / mL).

Figura 4. Idrogel singola costruzione contenenti cellule vive etichettati con calceina AM (verde) e le cellule morte etichettati con etidio omodimero-1 (rossa) dopo 24 ore in mezzo di crescita (5x10 ³ celle / mL).

Cella Figura 5. PEG restrittive polimerizzate come un film sottile utilizzando un "modello di prova" per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene di supporti permeabili. A, B) le cellule vive sono etichettati dopo 48 ore con calceina AM (verde), mentre le cellule morte vengono etichettati con etidio omodimero-1 (rossa). Adesione cellulare minima si verifica nella zona contenente il film sottile PEG.

Figura 6. Immagini rappresentative dei risultati indesiderati. A) polimerizzazione parziale della PEG, portando ad una PEG inutilizzabile costruire. Polimerizzazione improprio può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel pre-polimero medio, quantità insufficienti di media polimerizzazione, esposizione ai raggi UV insufficiente o non corretta messa a fuoco delle ottiche. B) immagine raffigurante polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). I neuriti sono stati in grado di crescere al di fuori dei canali PEG fantasia. Ciò si verifica spesso nella condizione che trabocca Puramatrix sulla parte superiore della porzione PEG durante l'iniezione.

Discussione

Il metodo descritto nel presente documento può essere utilizzato da qualsiasi investigatore alla ricerca semplice e riproducibile sistemi di colture cellulari. Teoricamente, a causa della grande varietà di idrogel photopolymerizable disponibili, l'ambiente potrebbe essere adattato per consentire l'utilizzo con qualsiasi tipo di cellula, compreso espianti di tessuto intero. Inoltre, il sistema duale idrogel permette di migliorare il controllo dello spazio nella presentazione di auto-polimerizzazione idrogel, che tendono a creare forme amorfe da soli. La risultante "2,5 D" costruisce idrogel micropatterned fornire una matrice 3D di crescita neurale presentato in una configurazione 2D che permette conveniente valutazione microscopica. Il substrato su cui si polimerizzato il gel può essere variata, consentendo un maggiore controllo nel disegno sperimentale. I nostri metodi sono ottimizzati per l'uso con supporti colture cellulari permeabili, come abbiamo visto viabilità migliorata (Figura 4) rispetto alla polimerizzazione su vetrini (dati non riportati). Tuttavia, le superfici di polimerizzazione altri possono essere più applicabile per diverse applicazioni: lavorazione su vetro slide utilizzate negli esperimenti di microfluidica o formazioni aggregato di cellule, per esempio.

La nostra esperienza con questi sistemi cultura ha portato all'identificazione di potenziali aree di difficoltà. In primo luogo, le tecniche di cura sono tenuti a mantenere la sterilità dei costrutti. A causa della natura ingombrante della configurazione DMD, è difficile operare passi polimerizzazione in condizioni sterili. Per combattere questo problema, il risciacquo passo descritto nei metodi è utile, e gli antibiotici devono essere utilizzati in tutti i media. Inoltre, lo spessore finale e la forma del costrutto polimerizzato è fortemente dipendente dal comportamento fluido del pre-polimero misto, e la presenza di un menisco può portare a costrutti gel che sono troppo sottili o non completamente polimerizzati (Figura 6). A due passi possono essere adottate per minimizzare la formazione di un menisco interno inserisce colture cellulari. Per idrogel di spessore (> 200 micron), un semplice rivestimento di pioggia-X attorno alla parete interna dell'inserto è sufficiente. Tuttavia, come brevemente descritto sopra, per i costrutti sottili (<200 micron), uno strato di olio è necessario per minimizzare sia il menisco e negare tempra ossigeno della polimerizzazione dei radicali liberi. Risoluzione è risultato essere dipendente da spessore, con una diminuzione della dimensione del tratto realizzato con gel sempre più spesso. La risoluzione inoltre varia a seconda che la funzione di rappresentare un rilievo positivo o negativo in idrogel. Tuttavia, abbiamo ottenuto una risoluzione sufficiente per le costruzioni con dimensioni caratteristiche minimo sulla scala di circa 100 micron con obiettivi microscopio solo come messa a fuoco dell'ottica.

I nostri esperimenti hanno mostrato che i costrutti idrogel dual qui descritti costituiscono una base eccellente per la formazione di base in vitro modelli di crescita dei neuriti e di orientamento. La tecnica impiegata micropatterning è un adattamento dei metodi esistenti ^18,19, ma il nostro set-up ha sottolineato un semplice da implementare la progettazione ed è stato ottimizzato per la produzione di costrutti idrogel duplice inserti colture cellulari; inserti in colture cellulari sono stati di vitale importanza per migliorare la vitalità cellulare e come reticolazione intorno espianti tessuto precedentemente aderente. Il campo di applicazione i risultati mostrati è limitata dagli interessi del nostro laboratorio, tuttavia, riteniamo che i metodi descritti in questa pubblicazione si rivelerà utile per i ricercatori alla ricerca di un relativamente a buon mercato, metodo veloce e facile da usare per la fabbricazione di coltura cellulare 3D modelli.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Micromirror Device		Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support		Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support		Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium		Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum		Invitrogen	16000-036
L-glutamine		Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor		Invitrogen	13257-019
Pen/Strep		Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement		Invitrogen	17504-044
DPBS		Invitrogen	14190-250
Puramatrix		BD Biosciences	354250
PEG 1000		Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959		Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil		Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000		Exfo
Rain-X