Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

Riepilogo

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E 'vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

Abstract

Crioconservazione di embrioni di topo è una base tecnologica che supporta scienze biomediche, perché molti ceppi di topi sono stati prodotti da modificazioni genetiche e il numero è costantemente aumentando di anno in anno. Il suo sviluppo tecnico è iniziato con i metodi di congelamento lento nel 1970 ^1, seguito da metodi di vetrificazione sviluppati alla fine del 1980 ^2. In generale, la tecnica di questi ultimi è vantaggioso nella sua rapidità, semplicità e capacità di sopravvivenza elevato di embrioni recuperati. Tuttavia, i crioprotettori contenuti sono altamente tossici e possono influenzare il successivo sviluppo embrionale. Pertanto, la tecnica non era applicabile a alcuni ceppi di topi, anche quando le soluzioni sono raffreddato a 4 ° C per mitigare l'effetto tossico durante la manipolazione degli embrioni. Al Bioresource RIKEN Center, più di 5000 ceppi di topi con differenti background genetici e fenotipi sono mantenuti ^3, e quindi abbiamo ottimizzato a te vetrificazionechnique con i quali siamo in grado di crioconservare embrioni da molti diversi ceppi di topi, con i benefici di sopravvivenza dell'embrione alto dopo vetrificazione e scongelamento (o liquefazione, più precisamente) a temperatura ambiente ^4.

Qui vi presentiamo un metodo di vetrificazione per embrioni di topo che è stato utilizzato con successo presso il nostro centro. La soluzione crioconservazione contiene glicole etilenico invece di DMSO per ridurre al minimo la tossicità di embrioni ^5. Esso contiene inoltre Ficoll e saccarosio per la prevenzione delle devetrificazione e regolazione osmotica, rispettivamente. Gli embrioni possono essere gestite a temperatura ambiente e trasferiti in azoto liquido entro 5 minuti. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Abbiamo anche descrivere la procedura di scongelamento di embrioni vetrificata nel dettaglio, perché è un critico step per il recupero efficiente dei topi vivi. Queste metodologie sarebbe utile a ricercatori e tecnici che hanno bisogno di conservazione dei ceppi di topi per un uso successivo in modo sicuro e conveniente.

Protocollo

Lo schema generale di questo esperimento è mostrato in fig. 1.

1. Preparazione dei reagenti

1. Rendere il terreno base (qui in nota come PB1) in una bottiglia da 100 ml in vetro secondo la seguente tabella di seguito:

   	MW	mM	mg/100ml
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   Glucosio	180,2	5,56	100,0
   Na piruvato	110	0,33	3,6
   CaCl 2, 2H 2 O	147	0,9	13,2
   Penicillina G			6,0 (circa)

2. Rendere il Ficoll-saccarosio (FS) soluzione:
   1. Aggiungere le seguenti sostanze chimiche a 14 ml di PB1 soluzione, in tubo da 50 ml.

      Ficoll 70	6,0 g
      Saccarosio	3,424 g
      BSA	42,0 mg

   2. Mescolare Ficoll 70 e saccarosio in PB1 soluzione e agitare bene fino a completo scioglimento.
   3. Dopo aver controllato completa dissoluzione sopra, aggiungere BSA sulla superficie della soluzione e la tiene a4 ° C fino a BSA è completamente sciolto (> 4 ore o durante la notte).
3. Rendono la soluzione di equilibrio (EFS20) e la soluzione vetrificazione (EFS40) in una provetta da 50 ml:
   • EFS20: 20% (v / v), glicole etilenico, il 24% (w / v) Ficoll, e 0,4 mol / L di saccarosio in PB1 con BSA
   • EFS40: 40% (v / v), glicole etilenico, il 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L di saccarosio ^* in PB1 con BSA
     ^* Per gli embrioni dal ceppo BALB / c o ICR, aumentare la concentrazione di saccarosio di 0,9 mol / L di saccarosio perché sono più sensibili ai cryodamage ^6.

   	EFS20 soluzione	EFS40 soluzione
   Glicole etilenico	1 ml	2 ml
   FS soluzione	4 ml	3 ml

4. Sterilizzare la soluzione per filtrazione con un filte 0,45 micronr. Fai aliquote in provette da 5 ml in polistirolo e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 6 mesi.
5. Preparazione della soluzione scongelamento degli embrioni contenenti saccarosio 0,75 M (TS1)
   1. Sciogliere 7,7 g di saccarosio in PB1 (preparato nel passo 1.1) e portare il volume complessivo di 30 ml. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto.
   2. Aggiungere 90 mg di BSA sulla superficie della soluzione e lasciare riposare fino a completo scioglimento.
   3. Sterilizzare la soluzione per filtrazione.
   4. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.
   
   Nota: TS1 può anche essere disponibili in commercio preparati a partire da M2.
   
   6. Sciogliere 7,7 g di saccarosio in M2 e portare il volume complessivo di 30 ml.
   7. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto.
   8. Sterilizzare la soluzione per filtrazione.
   9. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.
6. TS2 (soluzione scongelamentocontenenti saccarosio 0,25 M):
   1. Diluire 10 ml TS1 con 20 ml di PB1 o M2, a seconda dei casi.
   2. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.

2. Vetrificazione di 2-cell embrioni di topo

1. Preparare 2-cellule da embrioni di topo accoppiamento naturale o convenzionale nelle tecniche di fecondazione in vitro.
2. Aliquota 50 microlitri EFS40 in un CryoTube. D'ora in poi, eseguire il resto della procedura di vetrificazione a temperatura ambiente.
3. Aliquota 50 ml di EFS20 sul fondo di una 35 mm o 60 mm piatto di plastica Petri.
4. Trasferimento fino a 30 embrioni per EFS20 utilizzando un capillare di vetro con solo la quantità minima di terreno di coltura. Avviare un timer per 2 min.
   Nota: gli embrioni Posizionare sul fondo della goccia. Questo rende la disidratazione efficiente degli embrioni. Controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio. Embrioni disidratati mostrano una morfologia rimpicciolito, come mostrato in fig. 2A.Se non sono abbastanza disidratato, attendere per più di 1 o 2 min.
5. A circa 1,5 minuti, raccogliere gli embrioni dal menu EFS20 con solo la quantità minima della soluzione. Trasferirli EFS40 nel CryoTube preparato in 2.1 passo. Nota: Per ottenere risultati ottimali, regolare il tempo di raccogliere gli embrioni in modo che tutti gli embrioni possono essere trasferiti in EFS40 a circa 2 min.
6. Attendere 1 min.
7. Mettere il CryoTube direttamente in azoto liquido (LN _2).

3. Scongelamento vetrificati 2-cell embrioni di topo

1. Prima di scongelamento, preparare un piatto con 10 gocce ml di terreno di coltura degli embrioni per gli embrioni di recupero (vedi punto 3.13). Coprire il piatto con l'olio e mettere in un incubatore CO ₂ fino al momento dell'uso. Nota: Anche se tutti i mezzi per la coltura degli embrioni di routine possono essere utilizzati in questo esperimento, si consiglia di media con maggiore osmolarità come medium M16.
2. TS1 caldo a 37 ° C.
3. Indossare una maschera viso e cryogloves. Aprire la LN ₂ tank e recuperare un CryoTube contenente gli embrioni.
4. Aprire rapidamente la parte superiore del tubo ed eliminare LN _2. Attendere 30 secondi per evitare TS1 dal gelo nel passaggio successivo.
5. Utilizzare una pipetta 1000ul aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) nella provetta e miscelare la soluzione da pipettings dolce (circa dieci volte in 25 secondi) fino a quando la soluzione è sciolto in modo uniforme.
6. Trasferire l'intero volume del tubo di plastica ad una parabola di 60 millimetri Petri (o un vetro da orologio) (Fig. 3A). Nota: Gli embrioni devono essere gestiti a temperatura ambiente (22-25 ° C) fino a quando non sono posti in un incubatore a CO ₂ Passo 3.14.
7. Avviare un timer per 3 min.
8. A circa 2 minuti in TS1, agitare delicatamente il piatto fino a quando il supporto contenente embrioni si sviluppa sulla superficie del piatto (Fig. 3B). Nota: Questo aiuterà gli embrioni andare fino in fondo perché sono galleggianti in prossimità della superficie quando vengono trasferiti su TS1.
9. Mettete tre da 50 ml di gocce su TS2 °e piatto (Fig. 3C).
10. Dopo 3 minuti in TS1, controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio, ma dovrebbe essere leggermente rimpicciolito. Vedere la morfologia degli embrioni in precedenza (Fig. 2B) e più tardi (Fig. 2C) in TS1. Nota: Se gli embrioni sono ancora gonfi, tenerli in TS1 per di più 1 per 3 min.
11. Raccogliere gli embrioni e trasferirli la prima goccia di TS2 (Fig. 3D). Avviare un timer per 3 minuti
12. Dopo 3 minuti, trasferire gli embrioni per la seconda goccia e poi alla terza derivazione (Fig. 3E).
13. Trasferire gli embrioni al mezzo di coltura preparato a punto 3.1. Gli embrioni sono a forma mostrato in fig. 2D.
14. Piatto posto in un incubatore CO _2. Circa 10 minuti dopo, il trasferimento di embrioni per la caduta successiva del terreno di coltura per lavare saccarosio che è stato riportato da TS2.
15. Continua la cultura in un incubatore a CO2 fino al trasferimento degli embrioni.
    Nota: Il trasferimento Embryos alla ovidotti delle femmine destinatario il giorno del disgelo. Cultura lungo in vitro può diminuire la vitalità degli embrioni in alcuni ceppi di topi.

4. Rappresentante dei risultati:

In vitro - e in vivo, lo sviluppo di embrioni dopo lo scongelamento è presentato nelle tabelle 1 e 2. I vantaggi di questo protocollo sono l'elevata capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento e la sua vasta applicabilità a diversi ceppi di topi.

Tensione	Numero totale di tubi	Numero di embrioni vetrificata	Recupero (N. (%))	Morfologicamente normali (N. (%))	Sviluppo di blastocisti (N. (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / cA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Tabella 1. In vitro, sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati in ceppi di topo comune

Condizione di embrioni	Numero di femmine destinatario	Numero di embrioni trasferiti	Siti di impianto (n. (%))	Vivere prole (N. (%))
Fresco	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Vetrificati	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

Tabella 2. In vivo-sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati nei topi C57BL/6J.

Figura 1. Lo schema complessivo dell'esperimento, comprese equilibrio, vetrificazione, e lo scongelamento degli embrioni.

Figura 2. La morfologia degli embrioni in ogni fase del disgelo.

Figura 3. Procedura di scongelamento di embrioni. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. (A), Aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) in un CryoTube e trasferire l'intero volume della soluzione in CryoTube su un piatto di plastica. A questo punto, gli embrioni aspetto gonfio come mostrato in fig. 2B. (B), Stendere la soluzione sulla superficie del piatto da parte agitando delicatamente. (C), Place tre da 50 ml di gocce TS2 sul piatto di plastica. (D), trasferimento degli embrioni per la prima goccia di TS2. Dopo 3 minuti, gli embrioni aspetto shurunken come mostrato in fig. 2C. (E), Trasferimento li serialeLy in TS2 restanti gocce e poi al mezzo di coltura.

Discussione

Dal momento che il primo rapporto di vetrificazione del mouse embrione da Rall e Fahy nel 1985 ^2, diversi miglioramenti tecnici sono stati fatti per aumentare la capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento. Una delle modifiche di maggior successo è stato ottenuto mediante l'uso di glicole etilenico come crioprotettore a causa della sua bassa tossicità ed elevata permeabilità di membrana. Tali vantaggi ci permettono di gestire il congelamento degli embrioni a temperatura ambiente ^4; metodi di vitrificazione altri richiedono embrione consegna a temperature più fredde e non sono sempre applicabili ad alcuni ceppi di topi compresi BALB / c ^6. A base di glicole etilenico la prima vetrificazione è stato sviluppato da Kasai et al. nel 1990 ^5,7. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Pertanto, il metodo di vetrificazione qui descritte possono essere applicable a molti laboratori usando topi come modelli di ricerca. Lo stesso metodo può essere utilizzato anche per embrioni di topo a morula e di blastocisti fasi ⁸ e ⁹ embrioni di ratto. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che la qualità del cryotubes possono influenzare i tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo il congelamento-scongelamento. Quindi, è essenziale esaminare la superficie interna del cryotubes per la sua morbidezza gli embrioni prima di vetrificazione (ad esempio, vedere tabella di reagenti e attrezzature specifiche).

Metodi di vetrificazione hanno molti vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di congelamento lento, ma di per sé hanno uno svantaggio rispetto a scopo di trasporto. Come embrioni vetrificata deve essere mantenuto al di sotto dei -120 ° C per mantenere la loro vitalità, spedizionieri a secco sono generalmente utilizzati per il loro trasporto sicuro. Spedizionieri secco sono pesanti e ingombranti, e la loro andata e ritorno è costoso, soprattutto per il trasporto internazionale. Ora siamo attualmente sviluppando un nuovo metodo di vetrificazioneche gli embrioni vetrificate possono essere conservati a temperatura di ghiaccio secco (circa -80 ° C) per almeno 7 giorni ^10. Questo metodo dovrebbe essere la vetrificazione della prossima generazione.

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Albumina di siero bovino	Merck Biosciences (Calbiochem)	12657
Glicole etilenico	Pure Wako Chemical Industries	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glucosio	Pure Wako Chemical Industries	041-00595
NaCl	Pure Wako Chemical Industries	191-01665
KCl	Pure Wako Chemical Industries	163-03545
KH 2 PO 4	Pure Wako Chemical Industries	169-04245
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O	Pure Wako Chemical Industries	500-04195
MgCl 2 · 6H 2 O	Pure Wako Chemical Industries	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	Pure Wako Chemical Industries	031-00435
Penicillina G	Sigma-Aldrich	P-4687
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P-8574
Saccarosio	Pure Wako Chemical Industries	196-00015
M16 media	Sigma-Aldrich	M7292
M2 di media	Sigma-Aldrich	M7167
CryoTube	Sumitomo Bakelite	MS-4501	"Vial criogenici"