Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Resumo

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Resumo

Criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que suporta ciências biomédicas, porque muitas cepas de camundongos foram produzidos por modificações genéticas eo número está aumentando de forma consistente ano após ano. O seu desenvolvimento técnico começou com lentidão métodos de congelação na década de 1970 ^1, seguido por métodos de vitrificação desenvolvido no final dos anos 1980 ^2. Geralmente, a última técnica é vantajosa em sua rapidez, simplicidade e alta capacidade de sobrevivência de embriões recuperados. No entanto, o crioprotetores contidas são altamente tóxicos e podem afetar o desenvolvimento embrionário subseqüente. Portanto, a técnica não era aplicável a certas cepas de camundongos, mesmo quando as soluções são refrigerados a 4 ° C para mitigar o efeito tóxico durante a manipulação de embriões. No Bioresource RIKEN Center, mais de 5000 linhagens de camundongos com diferentes backgrounds genéticos e fenótipos são mantidos ^3, e, portanto, ter otimizado a te vitrificaçãonão haver descrição prévia com a qual podemos criopreservar embriões de várias espécies diferentes de camundongos, com os benefícios de sobrevivência embrionária após a vitrificação alta e descongelamento (ou liquefação, mais precisamente), à temperatura ambiente ^4.

Aqui, apresentamos um método de vitrificação para embriões de camundongos que tem sido utilizado com sucesso no nosso centro. A solução de criopreservação contém etileno glicol, em vez de DMSO para minimizar a toxicidade de embriões ^5. Ele também contém Ficoll e sacarose para a prevenção de desvitrificação e ajuste osmótico, respectivamente. Embriões podem ser manipulados em temperatura ambiente e transferida em nitrogênio líquido dentro de 5 min. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Descrevemos também o processo de descongelamento de embriões vitrificados em detalhes porque é um ste críticap para a recuperação eficiente de camundongos vivos. Estas metodologias seria útil para pesquisadores e técnicos que necessitam de preservação das linhagens de camundongos para uso posterior em uma maneira segura e rentável.

Protocolo

O esquema geral do experimento é mostrado na figura. 1.

1. Preparação do Reagente

1. Tornar o meio de base (aqui no conhecido como PB1), em uma garrafa de vidro de 100 ml de acordo com o gráfico abaixo:

   	MW	mM	mg/100ml
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   Glucose	180,2	5,56	100,0
   Na piruvato	110	0,33	3,6
   CaCl 2, 2H 2 O	147	0,9	13,2
   Penicilina G			6.0 (aprox)

2. Fazer o Ficoll-solução de sacarose (FS):
   1. Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml.

      Ficoll 70	6,0 g
      Sacarose	3,424 g
      BSA	42,0 mg

   2. Mix Ficoll 70 e sacarose em PB1 solução e agitar bem até dissolver completamente.
   3. Depois de verificar a completa dissolução acima, adicione BSA na superfície da solução e mantê-la4oC até BSA esteja completamente dissolvido (> 4 horas ou durante a noite).
3. Fazer a solução de equilíbrio (EFS20) ea solução de vitrificação (EFS40) em um tubo de 50 ml:
   • EFS20: 20% (v / v) etilenoglicol, 24% (w / v) Ficoll, sacarose e 0,4 mol / L em PB1 com BSA
   • EFS40: 40% (v / v) etilenoglicol, 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L de sacarose ^* em PB1 com BSA
     ^* Para embriões da linhagem BALB / c ou ICR, aumentar a concentração de sacarose a 0,9 sacarose mol / L, pois são mais sensíveis a cryodamage ^6.

   	EFS20 solução	EFS40 solução
   Etilenoglicol	1 ml	2 ml
   Solução de FS	4 ml	3 ml

4. Esterilizar a solução por filtração usando um filte 0,45 mMr. Faça alíquotas em 5 tubos de poliestireno ml e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 6 meses.
5. Preparação da solução embrião descongelamento contendo sacarose 0,75 M (TS1)
   1. Dissolver 7,7 g de sacarose na PB1 (preparada no passo 1.1) e trazer o volume total de 30 ml. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido.
   2. Adicionar 90 mg de BSA sobre a superfície da solução e deixá-lo ficar até que esteja completamente dissolvido.
   3. Esterilizar a solução por filtração.
   4. Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês.
   
   Nota: TS1 também podem ser preparados a partir de M2 ​​disponível comercialmente.
   
   6. Dissolver 7,7 g de sacarose em M2 e trazer o volume total de 30 ml.
   7. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido.
   8. Esterilizar a solução por filtração.
   9. Alíquotas e armazenar a 4oC. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês.
6. Solução TS2 (descongelamentocontendo sacarose 0,25 M):
   1. Diluir 10 ml TS1 com 20 ml de PB1 ou M2, conforme o caso.
   2. Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês.

2. Vitrificação de embriões de 2 células de rato

1. Prepare duas células de embriões de rato por monta natural ou convencional em técnicas de fertilização in vitro.
2. Alíquota de 50 mL em um EFS40 cryotube. Seguir, executar o resto do processo de vitrificação na temperatura ambiente.
3. Alíquota de 50 mL de EFS20 no fundo de um de 35 mm ou 60 mm placa de Petri de plástico.
4. Transferir até 30 embriões para EFS20 usando um capilar de vidro com apenas a quantidade mínima de meio de cultura. Iniciar um temporizador para 2 min.
   Nota: os embriões Coloque no fundo da gota. Isso faz com que a desidratação eficiente de embriões. Verificar a morfologia dos embriões por um estereomicroscópio. Embriões desidratados mostram uma morfologia encolhido, como mostrado na figura. 2A.Se eles não são desidratadas o suficiente, espere por mais 1 ou 2 min.
5. Em torno de 1,5 min, pegar os embriões a partir da queda EFS20 com apenas a quantidade mínima de solução. Transferi-los para EFS40 na cryotube preparada em 2.1 passo. Nota: Para obter melhores resultados, ajustar o tempo de pegar os embriões, para que todos os embriões podem ser transferidos para EFS40 em torno de 2 min.
6. Espere por 1 min.
7. Coloque o cryotube diretamente em nitrogênio líquido (LN _2).

3. Descongelar embriões vitrificados duas células-Mouse

1. Antes de descongelar, preparar um prato com 10 gotas mL de meio de cultura de embriões de embriões recuperados (veja o passo 3.13). Cubra o prato com azeite e coloque em uma incubadora _de CO ₂ até o uso. Nota: Apesar de todos os meios de cultura de embriões de rotina podem ser utilizadas neste experimento, recomendamos mídia com maior osmolaridade, como meio de M16.
2. TS1 quente a 37 ° C.
3. Coloque em uma máscara facial e cryogloves. Abra a LN ₂ tank e recuperar um cryotube contendo embriões.
4. Abrir rapidamente o topo do tubo e descartar LN _2. Aguarde 30 segundos para evitar o congelamento a partir de TS1 o próximo passo.
5. Use uma pipeta 1000ul para adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) dentro do tubo e misture a solução pipettings suave (cerca de dez vezes em 25 segundos) até que a solução está uniformemente dissolvido.
6. Transferência de todo o volume do tubo a uma 60 milímetros de plástico placa de Petri (ou vidro de relógio) (Fig. 3A). Nota: Os embriões devem ser manipulados em temperatura ambiente (22-25 ° C) até que eles são colocados em uma incubadora _de CO ₂ na Etapa 3.14.
7. Iniciar um temporizador para 3 min.
8. Em torno de 2 min no TS1, agite levemente o prato até o meio contendo embriões é espalhado sobre a superfície do prato (Fig. 3B). Nota: Isto ajudará os embriões descem até o fundo, porque eles estão flutuando perto da superfície quando transferido para TS1.
9. Coloque três gotas de 50 mL de TS2 em diae prato (Fig. 3C).
10. Depois de 3 min em TS1, verificar a morfologia de embriões por um estereomicroscópio, que devem ser ligeiramente encolhido. Veja a morfologia de embriões em anteriores (Fig. 2B) e posterior (Fig. 2C) no TS1. Nota: Se os embriões ainda estão inchadas, mantê-los em TS1 por mais 1-3 min.
11. Pegar os embriões e transferi-los para a primeira gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar um temporizador para 3 min
12. Depois de 3 min, transferência de embriões para a segunda gota e depois para a terceira queda (Fig. 3E).
13. Transferência dos embriões para o meio de cultura preparado no Passo 3.1. Os embriões são na forma mostrada na figura. 2D.
14. Coloque em um prato _de CO ₂ incubadora. Cerca de 10 min mais tarde, a transferência de embriões para a próxima gota de meio de cultura para lavar sacarose que foi transitado do TS2.
15. Continue cultura em uma incubadora de CO2 até a transferência de embrião.
    Nota: Embry TransferênciaOS para o oviduto de receptoras no dia da descongelação. Cultura in vitro tempo pode diminuir a viabilidade de embriões em algumas linhagens de camundongos.

4. Resultados representativos:

In vitro - e in vivo de embriões desenvolvimento após o descongelamento é apresentado nas Tabelas 1 e 2. As vantagens deste protocolo são a alta capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento e sua ampla aplicabilidade para diferentes linhagens de camundongos.

Tensão	No. total de tubos	N º de embriões vitrificados	Recuperado (No. (%))	Morfologicamente normais (N º (%))	Desenvolvimento de blastocistos (n º (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / ca	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Tabela 1. In vitro-desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em linhagens de camundongos comuns

Condição de embriões	N º de beneficiários do sexo feminino	N º de embriões transferidos	Locais de implantação (No. (%))	Vivem descendentes (No. (%))
Fresco	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Vitrificados	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

Tabela 2. In vivo desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em camundongos C57BL/6J.

Figura 1. O esquema geral do experimento, incluindo equilíbrio, vitrificação e descongelamento de embriões.

Figura 2. A morfologia de embriões em cada etapa do descongelamento.

Figura 3. Thawing procedimento de embriões. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente. (A), Adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) em um cryotube e transferência de todo o volume da solução no cryotube em um prato de plástico. Neste momento, os embriões olhar inchado como mostrado na figura. 2B. (B), espalhe a solução sobre a superfície do prato, agitando suavemente. (C), coloque três gotas de 50 mL de TS2 no prato de plástico. (D), Transferência de embriões para a primeira gota de TS2. Depois de 3 min, os embriões olhar shurunken como mostrado na figura. 2C. (E), transferi-los de sériely no TS2 restantes gotas e depois para o meio de cultura.

Discussão

Desde o primeiro relato de vitrificação embrião de rato por Rall e Fahy, em 1985, ^duas, várias melhorias técnicas têm sido feitos para aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento. Uma das modificações mais bem sucedida foi conseguida através da utilização de etileno glicol como crioprotetor por causa de sua baixa toxicidade e alta permeabilidade da membrana. Tais vantagens permitem-nos lidar com embriões congelamento à temperatura ambiente ^4; métodos de vitrificação outras requerem embrião entregando a temperaturas mais frias e nem sempre são aplicáveis ​​a algumas linhagens de camundongos incluindo BALB / c ^6. O etileno glicol vitrificação primeiro baseado foi desenvolvido por Kasai et al. em 1990 ^5,7. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Portanto, o método de vitrificação aqui descrito pode ser applicable para muitos laboratórios usando ratos como modelos de pesquisa. O mesmo método também pode ser usado para embriões de camundongos na mórula e blastocisto estágios ⁸ e ⁹ embriões de ratos. No entanto, temos encontrado recentemente que a qualidade dos criotubos podem afetar as taxas de sobrevivência dos embriões após o congelamento-descongelamento. Assim, é essencial para examinar a superfície interna do criotubos por sua suavidade antes de embriões vitrificação (por exemplo, ver a Tabela de reagentes e equipamentos específicos).

Métodos de vitrificação têm muitas vantagens sobre métodos convencionais de congelamento lento, mas que inerentemente têm uma desvantagem em relação a finalidade de transporte. Como embriões vitrificados deve ser mantida a inferiores a -120 ° C para manter a sua viabilidade, carregadores secos são geralmente utilizados para o seu transporte seguro. Carregadores secos são pesados ​​e volumosos, e sua ida e volta é caro, especialmente para o transporte internacional. Estamos agora a desenvolver um método de vitrificação novoque os embriões vitrificados podem ser armazenados em temperatura de gelo seco (cerca de -80 ° C) durante pelo menos sete dias ^10. Este método deve ser a vitrificação da próxima geração.

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Albumina de soro bovino	Merck Biosciences (Calbiochem)	12657
Etilenoglicol	Wako Pure Chemical Industries	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glicose	Wako Pure Chemical Industries	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
KH 2 PO 4	Wako Pure Chemical Industries	169-04245
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O	Wako Pure Chemical Industries	500-04195
MgCl 2 · 6H 2 O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	Wako Pure Chemical Industries	031-00435
Penicilina G	Sigma-Aldrich	P-4687
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P-8574
Sacarose	Wako Pure Chemical Industries	196-00015
M16 médio	Sigma-Aldrich	M7292
Meio M2	Sigma-Aldrich	M7167
Criotubo	Sumitomo Bakelite	MS-4501	"Vial criogénicos"