Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Riepilogo

Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando il NucView 488 caspasi-3 substrato. Questa tecnica è applicabile per le analisi programmate morte cellulare in tempo reale in una varietà di tipi di cellule e tessuti.

Abstract

Il sistema nervoso centrale possono sperimentare una serie di sollecitazioni e insulti neurologici, che possono avere numerosi effetti negativi che alla fine portano ad una riduzione della popolazione neuronale e la funzione. Assoni danneggiati possono rilasciare molecole tra cui potassio o eccitatorio glutammato nella matrice extracellulare, che a loro volta, possono produrre ulteriori insulti e lesioni alle cellule gliali di supporto tra cui astrociti e oligodendrociti ^{8, 16.} Se l'insulto persiste, le cellule saranno sottoposti a morte cellulare programmata (apoptosi), che è regolamentato e attivato da una serie di cascate di segnale ben consolidata trasduzione ^14. Apoptosi e necrosi dei tessuti può verificarsi dopo trauma cranico, ischemia cerebrale, e convulsioni. Un esempio classico di regolazione apoptotica è la famiglia di cisteina-dipendente aspartato-diretto proteasi, o caspasi. Proteasi caspasi attivate tra cui sono stati implicati nella morte delle cellule in risposta alla neuro cronicamalattie degenerative tra cui l'Alzheimer, la corea di Huntington e Sclerosi Multipla ^{4, 14, 3, 11, 7.}

In questo protocollo viene descritto l'uso del NucView 488 caspasi-3 substrato per misurare la velocità della caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti (OLG) colture cellulari ^{15, 5,} a seguito di esposizione a diverse sollecitazioni extracellulare, come alte concentrazioni di potassio o glutammato. Il condizionale-immortalata N19-Corte di Appello di linea cellulare (che rappresenta il capostipite O2A) è stato ottenuto dal Dott. Antonio Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) ^{15, 5,} ed è stato precedentemente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari di espressione genica mielina e trasduzione del segnale che porta OLG di differenziazione (ad esempio ^{6, 10).} Abbiamo trovato questa linea cellulare per essere robusto rispetto alla trasfezione con esogeni proteina basica della mielina (MBP) costruisce fusi a uno RFP o GFP (rosso o proteina verde fluorescente) ^13,12. Qui, il colture cellulari N19-Corte di Appello sono stati trattati con 80 mM di cloruro di potassio o 100 mM glutammato di sodio per imitare perdita assonale nella matrice extracellulare di indurre apoptosi ^9. Abbiamo usato un bi-funzionale della caspasi-3 contenente un substrato (Asp-Glu-Val-Asp) DEVD caspasi-3 subunità riconoscimento e un DNA-binding dye ^2. Il substrato entra rapidamente nel citoplasma dove viene scissa dalla intracellulare caspasi-3. Il colorante, NucView 488 è rilasciato e entra nel nucleo della cellula dove si lega il DNA e fluorescente verde a 488 nm, segnalando l'apoptosi. L'utilizzo del NucView 488 caspasi-3 substrato permette di vivere a cellule di imaging in tempo reale ^{1, 10.} In questo video, ci descrivono anche la coltura e trasfezione delle cellule immortalato N19-Corte di Appello, così come dal vivo di cellule tecniche di imaging.

Protocollo

1. Scongelamento e Cellule coltura

1. Ottenere stock di surgelati immortalato N19-oligodendrogliali cellule nei negozi di azoto liquido a lungo termine.
2. Immergere fiala contenente cellule a 37 ° C bagnomaria fino a quando la sospensione cellulare è completamente scongelati.
3. Aggiungere 7 ml di DMEM (Dulbecco Modified mezzo di Eagle) con alto glucosio supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% penicillina / streptomicina per un piatto di 10 centimetri cultura.
4. Aggiungere la cellula-sospensione goccia a goccia alla piastra, e agitare delicatamente e rock la piastra Petri per disperdere le cellule in modo uniforme.
5. Celle di coltura a 34 ° C / _5% di CO2 incubatore.
6. Dopo 4 ore, i media aspirare dai piatti per rimuovere qualsiasi residuo di DMSO (dimetilsolfossido), che era stato usato come un crioprotettore, e sostituirla con mezzi freschi (7 ml di DMEM ad alto glucosio mezzi di comunicazione integrato con il 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina) .

2. Cellule Passaging

1. Al 70-80%confluenza (4-7 crescita giorni), aspirare i media dalle cellule.
2. Aggiungere 1 ml di tripsina 0,25% al ​​piatto. Pipetta tripsina per staccare le cellule (circa 5 minuti).
3. Effettuare le diluizioni appropriate per le condizioni sperimentali e il passaggio di ulteriori 10 cm per piatto futuri esperimenti con una densità di cellule non meno di 0,1 x 10 ⁶ cellule / ml.

Nota: Si dovrebbe passare le cellule almeno due volte dopo lo scongelamento prima di usarli per esperimenti.

3. Conteggio e placcatura cellule

1. Alle cellule piastra per live-cell imaging, trypsinize come descritto in precedenza.
2. Rimuovere circa 30 ml di cellule e contare con un emocitometro.
3. Inserire un coprioggetto di vetro rivestito in un piatto ben 6. Aggiungere celle al pozzo ad una densità di 0,1 x 10 ⁶ cellule / ml in 2 mL fenolo senza DMEM high-glucosio media, supplementato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, a 34 ° C / 5% di CO _2.
4. Permetterecellule di crescere durante la notte (16-20 ore) a 34 ° C / 5% di CO ₂ prima di trasfezione.

4. Trasfezione

1. Combina 100 ul serum-free media, 0,5-4 mg DNA plasmidico purificato, e 4 microlitri FuGENE HD (Roche). Vortex delicatamente per mescolare.
2. Vortice di nuovo brevemente e lasciare il DNA al complesso per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere FuGENE miscela DNA HD direttamente alle cellule in coltura. Inclinare delicatamente la piastra per miscelare.
3. Coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 34 ° C / 5% CO ₂ prima del trattamento o di sperimentazione.

5. Le cellule preparazione per il Live-Cell Imaging (LCI)

1. Accendere il Chamlide LCI live-cell box strumento di controllo per almeno 1 h prima si desidera avviare l'esperimento. La centralina di controllo regola anche la temperatura e l'umidità all'interno del Chamlide LCI, e regola il flusso dei premiscelati 5% di CO _2.

Nota: Si consiglia diattivare la casella di controllo fino a 3 ore prima di cominciare gli esperimenti per garantire che l'intera fase raggiunge i 34 ° C. Questo passo sarà ridurre la deriva focale, che è causato da fluxulation e la dilatazione termica del metallo come stadio si riscalda, durante l'imaging.

2. Lavorare in un flusso cappuccio, spruzzare il Chamlide magnetico di tipo camera di cultura, e pinzette, con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare per 5 minuti.
3. Rimuovere le cellule da incubatore e confermano che sono sani. Dovrebbero apparire aderente e ben diffuse sul vetrino di vetro con processi a membrana numerosi. Le cellule che sono stressati dalla transfezione non sono adatti per la sperimentazione, e avrà un ridotto numero di estensioni di processo, e spesso hanno un nucleo di forma irregolare.
4. Inclinare il 6 pozzetti e rimuovere il vetrino con le pinzette. Rapidamente posizionare il lato cellula coprioggetto su nel piatto fondo della camera di cultura. Non lasciare che il vetrino ad asciugare.
5. Attaccare il principale magneticocorpo della camera di cultura e aggiungere 500 microlitri di media dall'originale 6 pozzetti sulla parte superiore del vetrino coprioggetto. Riutilizzare questo supporto diminuirà la quantità di stress sul posto le cellule causato dai cambiamenti ambientali, e può anche essere utile per valutare i fattori extracellulari secreti.
6. Mettere il coperchio di vetro della camera di cultura.
7. Utilizzare un KimWipe spruzzato con il 70% di etanolo di togliere qualunque materiale residuo dal fondo del vetrino, che interferirebbe con la microscopia.
8. Posizionare la camera di cultura nel 34 ° C / 5% CO ₂ incubatore per 30 min. Questa operazione farà sì che la camera stessa si riscalda a 34 ° C per ridurre lo spostamento del vetrino come il metallo si riscalda.

6. Impostazioni microscopio

Immagini sono state acquisite qui utilizzando un microscopio Leica DMIRE2 invertito con un obiettivo relè personalizzati ed emissione passaruota filtro per il caricamento delle cartucce delle ruote multiple (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).

1. Campo chiaro - Lampada impostato a 2,5 V e tempo di esposizione a 240 ms.
2. Proteina fluorescente rossa (RFP) - Guadagno fissato a 140 per 200 ms.
3. Proteina verde fluorescente (GFP) - Guadagno fissato a 140 per 500 ms.
4. Il nostro microscopio ha una lampada dimmerabile piuttosto che un disco rotante per controllare la quantità di luce disponibile per le cellule. Gestiamo i nostri esperimenti con la luce al 90% della massima intensità della lampada.

7. Il trattamento di cellule con induttori apoptosi e NucView 488 Caspasi-3 substrato

1. E 'importante preparare grandi scorte di induttori dell'apoptosi in anticipo e congelarli in aliquote, in modo che le concentrazioni saranno coerenti tra esperimenti.
2. Il NucView 488 substrato è sensibile alla luce. Preparare aliquote di 15 microlitri per ridurre i tubi di gelo / disgelo, e conservare a -20 ° C coperto di carta stagnola. Lavora con la luce ambiente della stanza più bassa possibile per ridurre l'esposizione del NucVIEW 488 substrato alla luce, prima del suo utilizzo.
3. Recuperare la cultura della camera rapidamente dal termostato in modo che le cellule non sono esposti a una riduzione della temperatura. Posizionare la camera di cultura sulla camera ambientale del microscopio, e utilizzare pinze per tenere la camera di cultura di muoversi. A questo punto si dovrebbe anche abbassare le luci della stanza.
4. Accendere il 5% premiscelato CO ₂ serbatoio con doppio regolatore.
5. Utilizzando l'obiettivo 10x, messa a fuoco per trovare le celle sul monitor del computer con campo chiaro microscopia. Nota: si vorrebbe utilizzare la più grande apertura numerica sull'obiettivo con l'ingrandimento desiderato di ridurre il tempo di esposizione.
6. Fornire induttori di apoptosi nelle cellule (nel nostro caso 80 mM di potassio, o 100 mM glutammato), uno dei seguenti metodi possono essere utilizzati. Useremo la consegna di 80 mM di potassio come un esempio, utilizzando KCl sciolti come concentrato 10x nei nostri terreni di coltura tipica.
   1. Mezzi di scambio by perfusione lenta e locale:
      - Utilizzare una pompa peristaltica di mezzi di scambio nella camera di cultura con i nuovi media contenente 80 mM di potassio.
      - Una estremità del tubo consegnerà 10 ml di uno stock di 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM, e l'altra estremità del tubo sarà rimuovere il supporto dalla camera.
      - Vuoi che almeno uno scambio di supporti 10x per garantire che i media nella camera di sinistra ha la corretta concentrazione di potassio.
      - Dopo che i media si scambia, aggiungere 3 ml di NucView 488 substrato ai media nella camera. Pipetta per mescolare.
   2. Aggiunta diretta di 80 mm K ⁺ e NucView 488 substrato di media in camera di cultura:
      - Preparare una soluzione stock di 10x 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM.
      - Aggiungere 3 ml di substrato NucView 488 a 50 l di 10x 80 mM di potassio. Pipetta per mescolare. Aggiungi a 500 microlitri fenolo senza DMEM in camera di cultura.
      Nota: questo metodo èpreferito se siete interessati a mantenere o valutare la crescita o altri fattori secreti che possono essere presenti nei media originale. Abbiamo scoperto che la NucView 488 substrato è stabile in coltura cellulare per la sperimentazione della durata fino a 36 h.

8. Live-cell Imaging

1. Clicca sul canale rosso per visualizzare le cellule transfettate.
2. Selezionare e salvare intorno ad una decina di frame in cui ci sono parecchie cellule transfettate e salvare questi "punti tappa XY". A seconda della quantità di memoria del computer, si può essere limitato al numero di punti tappa che si sarà in grado di acquisire.
3. Hanno la immagini al microscopio di cattura (in campo chiaro, canale rosso e il canale verde) in questi stadio salvato punti ogni 6 minuti.
4. Qualsiasi colorazione verde che si vede durante le prime fasi degli esperimenti indicano probabile cellule che sono già in fase di apoptosi, di solito a causa di trasfezione e / o di stress ambientale. ApoptOsis a causa di trattamenti sperimentali verrà rilevato in un timepoint dopo l'esperimento.

9. Analisi Statistica

1. Per ogni esperimento, si programma il microscopio per acquisire punti XY più di raccogliere un set di dati di grandi dimensioni in modo efficiente. Ogni esperimento è eseguito in doppio o triplo, ed i dati sono compilati da esperimenti separati eseguiti in giorni diversi. Da ogni set di dati, analizziamo fino a 15 campi di visualizzare e confrontare il rapporto della caspasi-negativo alle cellule di caspasi-cellule positive (numero totale di celle nel campo di vista / numero totale di caspasi-cellule positive).

2. Le misurazioni registrate da ciascun set di dati sono raggruppati in un set campione più ampio, e sono quindi confrontati tra loro utilizzando una tabella ANOVA (p = 0,05). Mostriamo gli errori standard della media (SEM) di ogni esperimento, e quindi confrontare la differenza di mezzi con l'esecuzione di un test di Tukey mezzo di confronto (p = 0,05) per determinare which trattamenti sono significativamente diverse l'una dall'altra.

10. Rappresentante Risultati

Abbiamo descritto un esperimento per illustrare come il NucView 488 substrato può indicare un aumento del tasso di apoptosi di N19-Corte di Appello di colture cellulari a seguito di un trattamento con un'alta concentrazione di potassio extracellulare. L'N19-cellule sono state trasfettate con richiesta di offerta, e sono stati trattati con 3 ml NucView 488 substrato (controllo), o 3 ml NucView 488 substrato e 80 mm [K ^+] (trattamento). Le cellule sono state monitorate e le immagini sono state acquisite nel corso di un corso di 12 ore di tempo, che è adeguata per gli studi che coinvolgono insulti neurologici (Figura 1A). In condizioni di controllo, non abbiamo osservato una notevole quantità di apoptosi rispetto al 80 mm [K ^+] colture trattate (box hash), che ha mostrato circa il 45% delle cellule morte dopo 12 ore (Figura 1B). Il segnale verde sfondo osservanod nelle condizioni di controllo indica le cellule che sono in fase di apoptosi senza l'aggiunta di potassio extracellulare. Praticamente nessuna delle celle nella apoptosi mostra esperimento di controllo dal punto 12 h di tempo, anche se in altre situazioni gli esperimenti può essere richiesto di eseguire più a lungo. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10x. Bar = 100 micron.

Figura 1. (A) A 12 esperimento tempo h corso di N19 culture Corte di Appello di 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde). Le culture sono stati trattati con una concentrazione finale di 80 mM [K ^+] (pannelli a sinistra), o nessun trattamento come controllo (pannelli di destra). Le immagini sono state acquisite a intervalli di 6 minuti, e l'attivazione significativa di spaccati caspasi-3 (segnale verde) si può osservared in colture trattate con 80 mM [K ^+] all'interno del nucleo cellulare (scatola hash) rispetto al esperimento di controllo. (B) Percentuale di spaccati caspasi-3 celle (calcolato dividendo il numero totale delle cellule nel campo visivo di il numero totale di caspasi-cellule positive). Rispetto alle condizioni di controllo, abbiamo osservato circa la morte delle cellule del 45% a seguito K ^{+-trattamento} di 12 h.

SVideo 1. Un h 12 corso esperimento tempo di N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), insieme con vivaci immagini a campo e una a tre vie immagine risultante dalla fusione, in seguito al trattamento con 80 mM [K ^+].

SVideo 2. Un corso di 12 ore il tempo di sperimentare N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), con campo chiaro images e un tre vie immagine fusa. Nessun trattamento è stato applicato alle culture e N19-OLGs può essere visto migrazione attraverso il campo microscopio in contrasto con colture di cellule trattate con 80 mM [K ^+] (confrontare con SVideo 1).

Discussione

Anche se questo non è l'unico prodotto disponibile per il rilevamento fluorogenici apoptosi, ci sono diversi vantaggi significativi a utilizzare il NucView 488 substrato. Uno dei vantaggi principali è la capacità di seguire l'apoptosi in cellule vive in tempo reale, mentre la maggior parte prodotti alternativi o richiedono la lisi cellulare o hanno scarsa permeabilità delle cellule. Altri benefici includono ad alta sensibilità per il riconoscimento della caspasi-3, la permeabilità delle cellule di alta, bassa citotossicità, e nessuna interferenza con la progressione della apoptosi. Il substrato è anche bassa fluorescenza di fondo fino a quando non viene scissa e entra nel nucleo, che elimina fluorescenza di fondo. La sequenza della caspasi-3 riconoscimento contiene 3 cariche negative e il legame al DNA colorante ha una carica positiva ^2. Il DEVD-NucView 488 molecola ha quindi una carica netta negativa, che impedisce l'attivazione e vincolante del colorante al DNA nelle cellule in cui caspasi non è attivo.

Maintaining coerenza tra gli esperimenti è necessario per essere in grado di tracciare confronti significativi tra le repliche. Uno dei parametri principali per mantenere costante è la densità delle cellule, in quanto influenza il tasso di trasfezione. Ottenere elevati tassi di trasfezione in immortalato N19-Corte di Appello di colture cellulari è più difficile che con le altre linee cellulari comuni come HeLa o HEK293, ed è fortemente dipendente dalla densità, nella nostra esperienza di ^{12, 13.} La nostra migliore efficienza di trasfezione per le cellule sono state ottenute con Fugene HD (Roche) e sono normalmente circa il 15%, ma può raggiungere oltre il 30%, a seconda del costrutto. Conteggio delle cellule attento aiuterà ad ottenere tassi di trasfezione coerente. E 'anche importante per esporre le cellule dai trattamenti diversi per lo stesso grado di stress ambientale, in particolare quando si misurano i tassi di apoptosi. In particolare, la durata del tempo durante il quale sono esposte le cellule ai reagenti di trasfezione, o la quantità di esposizione alla luce, sono importanti variabili ambientaliAbles di prendere in considerazione, e deve rimanere costante attraverso esperimenti. Per le nostre applicazioni, abbiamo scoperto che raccogliendo un gran numero di campi-di-vista fornisce un campione sufficientemente ampio per fare confronti statisticamente significative [ibidem].

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
NucView 488 Kit Caspasi-3 Saggio di cellule vive	Biotium	30029
FuGENE HD reagenti di trasfezione	Roche	04709705001
Dulbecco modificato Aquila Media	Gibco	31053-028
0,25% tripsina	Gibco	15050-065
Siero bovino fetale	Gibco	12483-020
Penicillina / streptomicina	Gibco	15140122
# 1,5-25 mm vetro coprioggetto	Warner Instruments	64-0715
Chamlide CMB magnetico camera di coltura per 25 millimetri coprioggetto	Quorum Technologies	CM-B-40
Cellstart coltura tissutale 10 piatti centimetri	VWR	82050-576
BD Falcon 6-bene di coltura tissutale piatti	VWR	CA62406-161