Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Riepilogo

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Abstract

Infezione da virus dopo il trapianto di cellule staminali sono tra le cause più comuni di morte, specialmente dopo sangue cordonale (CB) trapianto (CBT) in cui l'organismo di certificazione non contiene numeri notevoli di virus-esperti cellule T in grado di proteggere il destinatario dalle infezioni ^{1. - 4} Noi e altri hanno dimostrato che virus specifica CTL generati da donatori sieropositivi e infuso al destinatario sono sicuri e protettivi. ^5-8 Tuttavia, fino a poco tempo, virus-specifiche cellule T non può essere generato dal sangue del cordone ombelicale, probabilmente a causa del assenza di celle di memoria virus-T specifiche.

Nel tentativo di imitare il meglio in condizioni di innesco in vivo di cellule T naive, abbiamo stabilito un metodo utilizzato CB derivate da cellule dendritiche (DC) trasdotte con un vettore adenovirale (Ad5f35pp65) contenente l'antigene immunodominante CMV pp65, quindi guidare specificità delle cellule T verso CMV e adenovirus. ⁹ Alla iniziazione, usiamo queste macchineDCs strutturati come anche cellule T CB-derivato in presenza delle citochine IL-7, IL-12 e IL-15. ¹⁰ Alla stimolazione secondo abbiamo usato EBV-trasformate cellule B, o EBV-LCL, che esprimono sia latente e litiche antigeni EBV. Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL sono usati per stimolare le cellule T in presenza di IL-15 alla seconda stimolazione. Stimoli successivi utilizzano Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL e IL-2.

Da 50x10 ⁶ cellule mononucleate CB siamo in grado di generare l'alto di 150 x 10 ⁶ cellule T virus-specifici che lisare antigene-pulsate obiettivi e citochine rilascio in risposta alla stimolazione antigenica. ¹¹ Queste cellule sono state prodotte in un modo conforme GMP utilizzando solo la frazione al 20% di una unità di sangue del cordone frazionato e tradotti per l'uso clinico.

Protocollo

1. Cella di isolamento mononucleare (giorno 0)

1. Inserire spike di luer femmina nella porta di uscita della frazione 20% della unità di sangue cordonale, collegare la siringa e rimuovere il sangue. Trasferimento sangue scongelati a 20 ml di RPMI riscaldato in tubo da 50 ml per centrifuga. Risciacquare sangue borsa dei cavi con 5 ml di RPMI e trasferire al tubo da centrifuga stessa.
2. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 400 x g. Aspirare il surnatante.
3. Risospendere le cellule in 20 ml di RPMI caldo. Cellule strato su 15 ml di Lymphoprep in tubo da 50 ml per centrifuga. Centrifugare 40 minuti a 400 x g.
4. Raccogliere l'interfaccia contenente le cellule mononucleari e lavare in 20 ml di RPMI. Centrifugare per 10 minuti a 450 x g.
5. Aspirare il surnatante e lavare in 20 ml di RPMI. Contare le celle e girare per 5 minuti a 400 x g.
6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 5 x 10 ⁶ cellule mononucleate / mL di Cellgenix DC media (privo di siero). Togliere 1 mL per EBV-LCL generazione e mettere in 15 mL centrifuge tubo.

2. Cellule dendritiche Generation (a partire dal giorno 0)

1. Piastra 2 ml di cellule (sono già a 5 x 10 ⁶ cellule / ml di DC media) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Lasciare in incubatore per 1-2 ore.
2. Dopo 1-2 ore, lavare le cellule non aderenti mediante lavaggio 3-4 volte con PBS. Raccogliere le cellule non aderenti e congelare. Aggiungere 2 mL / pozzetto di supporti contenenti CC 1000 U / ml di IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF.
3. 3-4 giorni dopo DC iniziazione, rifornire di IL-4 e GM-CSF aggiungendo 100 pl / pozzetto di supporti contenenti una concentrazione finale di 1000U/mL IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF.
4. Il giorno 5-6, raccolto la DC raschiando il bene con una pipetta di trasferimento. Contare le cellule grandi e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Aspirare media e risospendere CC a 2x10 ⁶ cellule / ml di DC media. Aggiungere 0,5 ml / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
5. Trasdurre la DC con il Ad5f35pp65 vettore in una cella per MOI di 10 unità infettive. Aggiungi vector a ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Incubare le cellule per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, aggiungere 1,5 mL / pozzetto di DC supporto contenente: 1000 U / ml di IL-4, 800 U / ml di GM-CSF, 10 ng / mL TNF-alfa, 1 pg / mL PGE-1, 100 ng / mL IL-6, e 10 ng / ml di IL-1beta. Queste citochine maturare i controller di dominio.

3. Generazione di EBV-LCL (a partire dal giorno 0)

1. Centrifugare la provetta contenente le x 5 10 ⁶ cellule mononucleate. Aggiungere 200 ml di concentrato EBV B95.8 surnatante e 1,8 ml di mezzo completo (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutammina) contenente ciclosporina (1 pg / mL).
2. Aliquotare 100 ml di cellule in 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e 200 pl in 5 pozzetti. Aggiungere 100 ml di mezzi completi ciclosporina + ai pozzetti contenenti solo 100 ml di cellule. Riempire i pozzetti rimanenti con acqua sterile.
3. Alimentare il settimanale LCL ed espandere da una piastra a 96 pozzetti a un 24-pozzetti dopo ~ 2 settimane. Dopo un'altra settimana, trasferire in un matraccio T25 ed il trasferimento settimana successivauna beuta T75. In questa fase si consiglia di congelare aliquote di LCL. Si richiede in genere 1 mese a generare un numero sufficiente di LCL.

4. CTL Initiation - 7 giorni dopo l'inizio delle DC

1. DC Harvest e irradiano a 30 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere DC in mezzi cellule T contenenti siero umano (45% RPMI, 45% CLICK, il 10% di siero umano, 2 mM L-glutammina) @ 1 x 10 ⁵ cellule dendritiche / mL.
2. Scongelare le cellule non aderenti a partire dal punto 2.2. Lavare le cellule, e contare. Risospendere a 2 x 10 ⁶ cellule non aderenti / ml in mezzi cellule T contenenti siero umano. Aggiungere 10 ng / ml di IL-7 e IL-12, e 5 ng / ml di IL-15. Aggiungere 1 ml di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 1 ml di DC per pozzetto. Riempire i pozzetti vuoti di 24 pozzetti con acqua sterile.
3. 7 giorni dopo l'inizio delle cellule T, mangimi e / o dividere le celle con i media delle cellule T contenenti siero umano.
4. 9-12 giorni dopo l'inizio delle cellule T, congelare le cellule T fino a quando il LCL sono pronti.
5. Once LCL si sono ampliati e sono diversi passaggi in fiasche T75, trasdurre l'LCL mediante centrifugazione per 5 minuti a 400 x g. Aggiungere il vettore al pellet cellulare ad una MOI di 100 unità infettive per cellula. Incubare per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, risospendere in mezzi completi a 5 x 10 ⁵ LCL / ml e aggiungere 2 ml per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti ^12.
6. Dopo 2 giorni, raccogliere il LCL e irradiano a 40 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere il LCL in mezzi cellule T contenenti siero umano a 2,5 x 10 ⁵ cellule / ml. Aggiungere 1 ml di LCL per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Inoltre, aggiungere 5 x 10 ⁶ LCL ad un dispositivo di coltura Grex40 e 5 ng / ml di IL-15. ¹³
7. Raccogliere le cellule T. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg, aspirare il surnatante, risospendere in mezzi e cellule T contenenti siero umano a 1 x 10 ⁶ cellule T / mL. Aggiungere 5 ng / ml di IL-15 e di aggiungere 1 ml / pozzetto di cellule T (totale di 1 x 10 ⁶ cellule T) al LCL che sono già in 24-pozzetti. Nel Grex40, portareil volume totale del supporto fino a 30 mL.
8. Il giorno 3-4 post-stimolazione, se le cellule confluenti sono poi divisi (nel piatto) 1:1 e aggiungere mezzo fresco contenente 50 U / ml IL-2. Se non sono confluenti poi semplicemente aspirare ½ media e sostituirlo con supporti contenenti 50 U / mL di IL-2. Nel Grex40, aspirare la metà dei mezzi di comunicazione, sostituire con mezzi freschi, e aggiungere 50 U / mL di IL-2.
9. Il giorno 7, ripetere come nel passo 4,6 ma utilizzare IL-2 nel giorno della stimolazione non, IL-15.

5. Risultati rappresentativi

Uno schema del GMP approvato dalla FDA protocollo di fabbricazione è rappresentato in figura 1. Il processo dura circa 50 giorni. Metodi tipici di generazione di virus-specifiche cellule T espandere preesistenti cellule T di memoria, tuttavia, il sangue del cordone non ha virus esperti cellule T, e quindi abbiamo bisogno di prime ingenuo T cellule ex vivo. Per fare ciò, usiamo cellule dendritiche e le citochine IL-7, IL-12 e IL-15,necessaria per generare specificità virale.

Dopo 3 stimolazioni, il rendimento deve essere superiore a 100x10 ⁶ celle. Se le cellule non siano disponibili sufficienti, stimolazioni supplementari possono essere eseguite fino a quando il numero desiderato di CTL sono disponibili. La maggior parte di queste cellule dovrebbe essere CD3 + con una miscela di CD4 + e CD8 + T cellule. Ci dovrebbe essere inferiore a 15% delle cellule NK (CD3-/CD56 +) e meno di 1% di cellule B CD19 + (Figura 2).

Il CTL estesa dovrebbe riconoscere l'antigene pp65 da CMV, hexon e Penton da adenovirus, nonché numerosi antigeni EBV che sono espressi sulla EBV-LCL. Quando la prova è in un saggio ELISPOT, CTL dovrebbe secernere più IFN-? in risposta a questi antigeni di antigeni irrilevanti (Figura 3).

Il CTL dovrebbe anche lisare virali peptide-pulsati tali obiettivi blasti PHA. In un saggio di rilascio Cr ^51, CTL dovrebbe lisare LCL, CMVpp65-pulsato e Adenovirus esone-e /o Penton-pulsato obiettivi, ma non obiettivi pulsate con peptidi irrilevanti (Figura 4).

Figura 1. Generazione di multi-virus CTL specifici dal cordone ombelicale. Schematico che mostra l'intero processo di fabbricazione CTL da cordone ombelicale. Prima le cellule mononucleate del sangue del cordone sono isolati dalla frazione 20% della frazionato unità di sangue del cordone ombelicale. Con l'eccezione di 5x10 ⁶ cellule salvate per generazione LCL, tutte le cellule vengono quindi piastrate in mezzi cellule dendritiche per 1-2 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono raccolte e congelate. La DC vengono poi alimentati DC supporti contenenti IL-4 e GM-CSF. Dopo 5 giorni di coltura, la DC sono maturato e trasdotte con un vettore adenovirale contenente l'antigene immunodominante CMV pp65. All'iniziazione DC questi sono combinati con le cellule non aderenti e le citochine IL-7, IL-12,e IL-15. A stimolazioni successive, lo stesso vettore adenovirale viene utilizzato per trasdurre EBV-LCL, che sono utilizzati come le cellule presentanti l'antigene. IL-15 viene utilizzato al secondo stimolazione e IL-2 in seguito.

Figura 2. Fenotipo delle cellule T risultante. Mostrata è la percentuale di cellule vive inclusi nel gate linfocitario. CTL sono CD3 + e CD4 + e CD8 +, ma in gran parte CD3-/CD56- e CD19-.

Figura 3. Funzionalità delle cellule T. Specificità delle cellule T è stato testato da IFN-γELISPOT. Le cellule T sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l'intera proteina di hexon, Penton, pp65, e l'antigene irrilevante IE-1. CTL da solo indica un mezzo solo. Autologo LCL sono stati irradiati e ha aggiunto a 1x10 ⁵ / bene. Viene mostrato il punto medio di formazione delle cellule cim porto di pozzetti in triplicato.

Figura 4. Attività citolitica dei CTL. La capacità del CTL risultante per lisare bersagli esprimenti antigeni virali è stato testato in un saggio di ⁵¹ Cr. ⁵¹ Cr-etichettati blasti autologhe PHA sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l'intera o antigene marcato con ⁵¹ Cr LCL autologhe sono stati co-coltivate con CTL. Dopo 4 ore, gamma di rilascio è stato contato in un contatore gamma.

Discussione

Attuali strategie volte a controllare le infezioni virali dopo CBT può essere efficace, ma sono associati a tossicità significative, sono costosi, e non conferiscono protezione a lungo termine contro l'infezione in seguito. In effetti, l'uso di alcuni farmaci antivirali possono limitare l'espansione del virus-specifiche cellule T che altrimenti sarebbero protettivo. ¹⁴ Un'altra opzione è l'infusione di donatore-derivati ​​virus-cellule T specifiche. Noi e altri hanno dimostrat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
RPMI 1640	Invitrogen	21870-076
DC supporti	CellGenix	20801-0500
EHAA (Medium Click di)	Irvine Scientific	9195
Siero umano	Gemini Bio Prodotti	100-110
Gas Permeabile Cultureware 18	Wilson-Wolf	80040S
IL-2	Chirone (TCH Farmacia)
IL-12	NCI / CTEP
IL-15	CellGenix	1013-050
IL-7	R & S	AFL207
IL-1beta	R & S	AFL201
IL-6	CellaGenix	1004-050
GM-CSF	TCH Farmacia
IL-4	R & S	AFL204
TNF-alfa	R & S	AFL210
Ad5f35pp65	BCM CAGT Vector Production Facility
Trasferimento al plasma con adattatore femmina luer	Carta Medical	89-550-66J
Lymphoprep	Nycomed	1114550