È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.
L'ossido nitrico (NO) è un biatomica radicale libero che è estremamente breve durata in sistemi biologici (meno di 1 secondo nel sangue circolante) 1. NO può essere considerato uno dei più importanti molecole di segnalazione prodotte nel nostro corpo, regolando le funzioni essenziali, incluso ma non limitato alla regolazione della pressione sanguigna, la risposta immunitaria e la comunicazione neurale. Pertanto, la sua rilevazione accurata e la quantificazione in matrici biologiche è fondamentale per comprendere il ruolo di NO nella salute e nella malattia. Con una breve semivita fisiologica di NO, strategie alternative per il rilevamento di prodotti di reazione di NO biochimica sono stati sviluppati. La quantificazione dei metaboliti NO rilevanti in diversi compartimenti biologici fornisce preziose informazioni per quanto riguarda il NO in vivo, la biodisponibilità di produzione e il metabolismo. Basta assaggiare un unico vano, come sangue o plasma non può sempre fornire una valutazione accurata di tutta body stato NO, in particolare nei tessuti. La possibilità di confrontare il sangue con i tessuti selezionati in animali da esperimento aiuterà a colmare il divario tra scienza di base e la medicina clinica per quanto riguarda utilità diagnostica e prognostica di NO biomarcatori nella salute e nella malattia. Pertanto, estrapolazione di plasma o sangue stato NO a tessuti specifici di interesse non è più un valido approccio. Come risultato, i metodi continuerà ad essere sviluppato e convalidato che permettono l'individuazione e la quantificazione dei prodotti NO e NO-correlati / metaboliti a compartimenti multipli di animali da esperimento in vivo. Il paradigma stabilito di NO biochimica dalla produzione da NO sintasi all'attivazione di guanylyl ciclasi solubile (SGC) all'ossidazione eventuale nitrito (NO 2 -) e nitrati (NO 3 -), può rappresentare solo una parte di NO gli effetti in vivo. L'interazione dei metaboliti NO e NO-derivati con tioli proteine, ammine secondarie, e metalli per formare S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosammine (RNNOs), e nitrosile-eme rappresentano rispettivamente cGMP indipendenti effetti di NO e probabilmente altrettanto importante fisiologicamente l'attivazione di SGC da NO. Una vera comprensione del NO nella fisiologia deriva da esperimenti in vivo di campionamento comparti multipli contemporaneamente. Ossido nitrico (NO) metodologia è una scienza complessa e spesso confusa e al centro di molti dibattiti e discussioni in merito NO biochimica. Il chiarimento di nuovi meccanismi e le vie di segnalazione che coinvolgono senza cerniere sulla nostra capacità di specifico, in modo selettivo e sensibile rilevare e quantificare NO NO e tutte le informazioni pertinenti prodotti e metaboliti nelle matrici biologiche complesse. Qui, viene presentato un metodo per l'analisi rapida e sensibile di nitriti e nitrati da HPLC e rilevamento di NO libero in campioni biologici utilizzando in chemiluminescenza dell'ozono vitro basato con derivitazation chimica per determinare la fonte di NO molecolare nonché ex vivo conorgano bagno myography.
1. Raccolta di sangue intero
2. Tissue estrazione e preparazione
3. Aortica isolamento Anelli per la funzione endoteliale
Tissue Organ Bath
4. Risultati rappresentativi
L'utilizzo del ENO-20 dedicato HPLC fornisce un facile da utilizzare il metodo per il rilevamento di un elevato throughput specifico e sensibile di nitriti e nitrati inmatrici biologiche. Il principio di rilevamento e un cromatogramma originale viene mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi campione biologico per la determinazione nitriti e nitrati. CLD rilevamento basato su di NO metaboliti richiede una fase di derivatizzazione chimica per determinare l'origine molecolare del NO. La configurazione sperimentale per la simultanea denitrosazione ossidativo e denitrosazione riduttiva per il rivelatore di chemiluminescenza è mostrato in Figura 2. Il recipiente di reazione a destra viene riempito con ferricianuro 800mm in PBS pH 7,4 e il recipiente di reazione a sinistra è riempito con ioduro di potassio / iodio miscela in acido acetico per denitrosazione riduzione (Figura 2A). L'intera impostazione è illustrata nella figura 2B. La Figura 3 illustra i saggi denitrosazione gruppo specifico in grado di rilevare e quantificare nitrosotioli, i nitriti, nitrosamine, così come i prodotti eme nitrosilici. Questo metodo è stato precedentemente descriletto e convalidato 4,5. Queste analisi biochimiche importanti possono essere facilmente correlati con studi funzionali sugli anelli aortici isolati per determinare la produzione di NO endoteliale negli animali da esperimento. Questo esperimento classica farmacologica può essere facilmente e valutare con precisione la funzione endoteliale e la produzione di NO. Misurazione reattività nave agonisti endoteliali come acetilcolina può determinare direttamente endoteliale produzione di NO che possono poi essere correlato con biomarcatori biochimici rilevati nel sangue e nei tessuti degli animali sperimentali. Una rappresentazione tipica di una dose-risposta all'acetilcolina è mostrato in Figura 4. Topi di controllo sani con normale funzione endoteliale rispondere a acetilcolina da rilassante. I topi con disfunzione endoteliale (topi ipercolesterolemici) mostrano il rilassamento ridotta a causa della ridotta produzione di NO allo stesso stimolo.
Ficoure 1. Principio di rilevamento di nitriti e nitrati da ENO-20 e cromatogramma del campione. (Top) Schema di ENO-20 metodo di rilevamento per nitriti e nitrati. (Basso) chromotogram standard di 10 pmol nitriti e nitrati iniettata ENO-20 (100 pl di soluzione 100 nM di nitriti e nitrati). Sensibilità di 1 nM per ogni anione con 100 pl di volume di iniezione. Nessuna interferenza con le proteine o specie colorate.
Figura 2. CLD setup sperimentale utilizzando sia denitrosazione ossidativo da denitrosazione ferricianuro e riduttivo con ioduro / iodio test con rilevazione di fase gas depurato gas ossido nitrico.
Figura 3. (Pannello A) individuazione Chemiluminescenza di nitrito, Royal Scottish National Orchestra, RNNO nel test denitrosazione riduttivo da una preincubazione del campione con il gruppo Chemic specificoal reagenti. Sottrazione delle aree dei picchi consentono di individuare nitriti e RSNOs. (Pannello B), rivelazione chemiluminescente di specie eme nitrosilici usando la soluzione ossidativo denitrosazione di ferricianuro. Questo metodo è specifico per NO-eme prodotti alcuna reattività incrociata con RSNOs (GSNO o SNO-albumina), o RNNO (NO-pirrolidina e N-nitroso-albumina).
Figura 4. Bagno ex vivo organo su anelli aortici isolati fornisce una misura diretta della produzione di NO endoteliale che possono poi essere correlato con marcatori biochimici rilevati mediante HPLC e CLD. Questa figura illustra il rilassamento ridotta nei topi affetti da disfunzione endoteliale dovuta a ridotta produzione di NO.
I metodi qui descritti per la quantificazione di metaboliti NO pertinenti a compartimenti multipli biologici consentirà di impronte digitali di NO biologia in salute e di malattia che possono essere correlati con misurazioni funzionali di NO da parte dell'endotelio. Questi metodi richiedono una preparazione semplice del campione con un potenziale di adattamento per un throughput elevato. La quantità relativa di queste molecole possono aiutare a comprendere la produzione di NO e il suo destino metabolico in un cert...
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Gli autori desiderano ringraziare Jiang Hong, Ph.D. e Deepa Parathasarthy, MPH, BDS per l'assistenza tecnica.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
N-etilmaleimmide | Thermo Scientific | 23030 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Ferricianuro di potassio | Fluka | 60299 | |
HPLC | EICOM Corp | ENO-20 | |
Autocampionatore | Alcott | ||
DMT miografo | AD Instruments | ||
PowerLab | AD Instruments | ||
Chemiluminescente | EcoPhysics | CLD 88Y | |
Centrifuga | Eppendorf | 5415D | |
Acetilcolina | Sigma-Aldrich | A6625 | |
R-(-) Fenilefrina | Sigma-Aldrich | P6126 |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon