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질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.
질소 산화물은 (NO) 생물 학적 시스템 (혈액 순환에 이하 일초) 1로 극히 짧은 살고있다 이원 자유 라디칼이다. 아니오는 포함한 필수 기능을 조절, 우리의 신체에서 생산되는 가장 중요한 신호 분자 중 하나를 고려 없지만 혈압, 면역 반응 및 신경 통신 규제에 국한되지 수 있습니다. 따라서 생물 학적 매트릭스에서의 정확한 탐지 및 부량는 건강과 질병에서 NO의 역할을 이해하기 위해 중요합니다. NO 이러한 짧은 생리적 반 생활을 통해 어떠한 생화학의 반응 제품의 탐지를위한 대안 전략이 개발되었습니다. 여러 생물 학적 구획의 관련 없음의 metabolites의 양을 정함은 생체내에에 관해서는 어떠한 생산, 생체 이용률과 신진 대사에 중요한 정보를 제공합니다. 간단히 같은 혈액이나 혈장과 같은 하나의 구획을 샘플링하는 것은 전체 보의 정확한 평가를 제공하지 않을 수 있습니다특히 조직에서 어떠한 자격을 마구 없습니다. 실험 동물의 선택 조직으로 혈액을 비교하는 기능까지 건강과 질병의 어떠한 생체 진단 및 전조 유틸리티 등 기초 과학 및 임상 의학 간의 격차를 해소하는 데 도움이됩니다. 따라서 관심의 특정 조직에 혈장 또는 혈액 어떠한 상태의 추정은 더 이상 유효한 접근하지 않습니다. 그 결과, 방법 개발 및 생체내의 실험 동물의 여러 구획의 NO 및 NO-관련 제품 / metabolites의 탐지 및 부량을 허용하는 검증받을 것을 계속한다. 과 질산염 (NO 3 -) - 아질산 (NO 2) 최종 산화에 대한 수용성 guanylyl cyclase (SGC)의 활성화에 어떠한 synthases에 의해 생산에서 어떠한 생화학의 설립 패러다임은 생체내에서 NO의 효과의 일부분에 해당됩니다. S-nitrosothi을 형성하는 단백질 thiols, 차 아민 및 금속과 NO 및 NO-파생 metabolites의 상호 작용ols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs) 및 nitrosyl-헴는 각각 NO의 cGMP 독립적인 효과를 나타내며 어떠한 의한 SGC의 활성화로 생리학 가능성만큼이나 중요하다. 생리학에서 NO의 진정한 이해는 동시에 여러 구획을 샘플링 생체내 실험에서에서 파생됩니다. 질소 산화물 (NO) 방법론은 어떠한 생화학에 대해서도 많은 논쟁과 토론의 복잡하고 종종 혼란 과학 및 초점이다. 우리의 능력을 구체적에 대한 어떠한 경첩과 관련된없는 새로운 메커니즘 및 신호 전달 경로의 해설은 선택과 sensitively 눈치채지 못한 어떠한와 관련된 모든 복잡한 생물 학적 매트릭스의 어떠한 제품과 metabolites을 수량. 여기서는 HPLC에 의한 아질산염과 질산염의 신속하고 민감한 분석 방법뿐만 아니라 NO의 분자 소스뿐만 아니라 전 생체내과를 결정하는 화학 derivitazation와 체외의 오존 기반 chemiluminescence에서 사용하는 생물 학적 시료의 여유 없음의 검출을 제시장기 목욕 myography.
1. 전체 혈액 수집
2. 조직 추출 및 준비
3. 내피 기능에 대한 대동맥 반지 격리
조직 장기 목욕
4. 대표 결과
이노-20 전용 HPLC의 이용은의 아질산염과 질산염의 구체적이고 민감한 검출을 위해 높은 처리량 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다생물 학적 매트릭스. 감지 및 원래의 크로마토 그램의 원리는 그림 1에 표시됩니다. 이 방법은 아질산염과 질산염을 결정하는 생물 학적 샘플을 사용할 수 있습니다. NO metabolites의 CLD 기반 감지 NO의 분자 소스를 결정하는 화학 derivitization 단계가 필요합니다. chemiluminescence 검출기를위한 동시 산화 denitrosation 및 reductive denitrosation위한 실험 설정은 그림 2에 표시됩니다. 오른쪽의 반응 용기는 PBS 산도 7.4의 800mM ferricyanide으로 가득차 있으며, 왼쪽에있는 반응 용기는 감소 denitrosation위한 초산 (그림 2A)에 칼륨 요오드화물 / 요오드 혼합으로 가득합니다. 전체 설정은 그림 2B에 표시됩니다. 그림 3은 그룹의 특정 denitrosation의 아질산을 감지하고 계량 수 assays, nitrosothiols, nitrosamines뿐만 아니라 nitrosyl 헴 제품을 보여줍니다. 이 방법은 이전에 descri되었습니다침대 4,5 검증. 이러한 중요한 생화 학적 분석은 쉽게 내피 실험 동물에있어서 어떠한 생산을 결정하지 위해 절연 대동맥 고리에 대한 기능적 연구와 상호하실 수 있습니다. 이것은 고전 pharmacological 실험은 쉽고 정확하게 내피 기능과 생산 아니오를 평가할 수 없습니다. 이러한 아세틸콜린과 같은 내피 agonists에 선박 반응을 측정하는 것은 바로 다음 실험 동물의 혈액과 조직에서 발견 생화학 생체와 상호하실 수 있습니다 내피 어떠한 생산을 결정할 수 없습니다. 아세틸콜린에 대한 선량 반응의 전형적인 표현은 그림 4에 표시됩니다. 정상적인 내피 기능과 건강한 컨트롤 마우스는 휴식에 의해 아세틸콜린에 반응한다. 내피 기능 장애와 쥐 (hypercholesterolemic 생쥐)는 동일한 자극에 어떠한 생산을 줄일 수 없다 때문에 감소 휴식을 보여줍니다.
무화과우레 1. 이노-20 및 샘플 크로마토 그램에 의한 아질산염과 질산염의 검출 원리. 아질산염과 질산염에 대한 검색의 이노-20 방식의 (위) 도식. (아래) 10 pmol의 아질산염과 질산염의 표준 chromotogram는 이노-20 (아질산염과 질산염 100 nm의 솔루션을 100 μl)에 주입. 100 μl 주입 부피 각 음이온 1 NM의 감도. 단백질이나 색 종 아무도 간섭 없습니다.
정화 질소 산화물 가스의 기상 탐지와 요오드화물 / 요오드 검정을 사용 ferricyanide하고 reductive denitrosation에 의해 모두 산화 denitrosation를 사용하여 그림 2. CLD 실험 설정.
그림 3. (패널) 그룹의 특정 chemic있는 샘플 preincubation 의해 reductive denitrosation 분석에서 아질산염의 Chemiluminescence 감지, RSNO, RNNO알 시약. 피크 영역의 뺄셈은 아질산염과 RSNOs의 검출을 허용합니다. ferricyanide의 산화 denitrosation 솔루션을 사용하여 nitrosyl 헴 종의 (패널 B) Chemiluminescent 탐지. 이 방법은 RSNOs (GSNO 또는 SNO-알부민) 또는 RNNO (NO-pyrrolidine와 N-nitroso-알부민)과 노 교차 반응으로 NO-헴 제품에만 적용됩니다.
그림 4. 절연 대동맥 고리에서 전의 생체내 기관 목욕 후 HPLC 및 CLD에 의해 감지 생화학 생체와 상호하실 수 있습니다 내피 NO 생산의 직접적인 측정을 제공합니다. 이 수치는 더 이상 생산 감소하지 인해하도록 내피 기능 장애와 생쥐의 감소 휴식을 보여줍니다.
방법은 여러 생물 학적 구획의 관련 없음의 metabolites의 부량 위해 여기에서 설명한 내피에 의한 NO의 기능 측정과 상호 수있는 건강과 질병의 어떠한 생물의 지문 채취를 허용합니다. 이러한 방법은 높은 처리량을 위해 적응을위한 잠재력을 지닌 간단한 샘플 준비가 필요합니다. 이러한 분자의 상대적인 수량은 질환의 실험적 모델과 인간의 환자에서조차 직렬 샘플 수가 NO의 생산과 신진 대사 운?...
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
저자 홍 지앙 박사에게 감사를 표합니다 그리고 Deepa Parathasarthy, 시속, 기술 지원 BDS.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
N-ethylmaleimide | 써모 과학 | 23,030 | |
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시그마 - 올드 리치 | E7889 | |
Ferricyanide 칼륨 | Fluka | 60,299 | |
HPLC | Eicom 사 | 이노-20 | |
Autosampler | Alcott | ||
DMT Myograph | 광고 인 스트 루먼트 | ||
PowerLab | 광고 인 스트 루먼트 | ||
Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
원심 분리기 | Eppendorf | 5415D | |
아세틸콜린 | 시그마 - 올드 리치 | A6625 | |
R-(-) Phenylephrine | 시그마 - 올드 리치 | P6126 |
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