Cura e manutenzione periodiche di Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorio: Introduzione

Riepilogo

Questo protocollo descrive una regolare manutenzione e cura per mantenere le condizioni ottimali per zebrafish allevamento. Il video illustra il protocollo per la manutenzione del sistema, regolarmente ad una casa, l'alimentazione, l'allevamento, e l'aumento di larve di zebrafish.

Abstract

Questo protocollo descrive la cura e la manutenzione regolare di un laboratorio zebrafish. Zebrafish stanno guadagnando popolarità nel campo della genetica, la ricerca farmacologica e comportamentale. Come un vertebrato, parti zebrafish considerevole genetica similarità di sequenza con gli esseri umani e vengono utilizzati come modello animale per varie patologie umane. I vantaggi di zebrafish in confronto ad altri modelli di vertebrati comuni includono fecondità elevata, bassi costi di manutenzione, embrioni trasparenti, e di rapido sviluppo. A causa della sperone di interesse per la ricerca zebrafish, la necessità di stabilire e mantenere una struttura alloggiativa produttiva zebrafish è in aumento. Sebbene la letteratura è disponibile per il mantenimento di un laboratorio zebrafish, un protocollo video concisa manca. Questo video illustra il protocollo di abitazioni regolari, alimentazione, riproduzione e allevamento di larve di zebrafish. Questo processo consentirà ai ricercatori di comprendere il comportamento naturale e le condizioni ottimali di zebrafish allevamento e quindi risolvere i problemi sperimentali che provengono da condizioni di allevamento dei pesci. Questo protocollo sarà di grande aiuto per i ricercatori che intendono creare un laboratorio zebrafish, e anche a studenti laureati che intendono utilizzare zebrafish come modello animale.

Protocollo

1. Manutenzione del sistema

1. Zebrafish sono conservati in un sistema di circolazione che continuamente filtri e arieggia il sistema di acqua per mantenere la qualità dell'acqua necessaria per un ambiente acquatico sano. Il sistema di circolazione consente inoltre di filtrare l'eccesso di cibo e gli escrementi dei pesci. Diverse aziende di fornire sistemi di zebrafish, ma usiamo i sistemi di habitat acquatici, Stati Uniti d'America nel nostro laboratorio. La temperatura ambiente o la temperatura del serbatoio è generalmente mantenuta tra 26-28,5 ° C e le condizioni di luce sono ore 14:10 (luce: buio). Un sistema di zebrafish da habitat acquatici (ad esempio, sistema da banco) costi ~ 9,000 USD. Questo sistema da banco a due ripiani può contenere sei da 10 litri, dodici da 3 litri, o 20 da 1,5 litri serbatoi su ogni singolo ripiano. Linee multiple di pesce (es. transgenica, mutante, wild type) possono anche essere alloggiati nello stesso sistema.
2. Un insieme di diversi tipi di filtri sono utilizzati nel sistema. Nel nostro sistema, l'acqua da tutte le vasche di paSSEs attraverso un filtro da 120 micron pad, 50-micron cartuccia del filtro, filtro biologico, filtro a carboni attivi assorbimento e filtro UV disinfezione prima di essere rimessi in circolo nella vasca. Acqua De-chlorinated/aged viene utilizzato nel sistema zebrafish. L'acqua può essere de-clorurati con l'invecchiamento per almeno 48 ore. In condizioni ideali, l'acqua deve essere conservato in un serbatoio con una pompa di circolazione dell'acqua per mantenerlo caldo, e accelerare la de-clorazione.
3. Il pH dell'acqua dell'impianto deve essere controllata quotidianamente e mantenuto tra 6,8 e 7,5. Quando necessario, bicarbonato di sodio deve essere utilizzato per aumentare il pH.
4. Acquari devono essere puliti regolarmente. Per pulire un acquario, chiudere il flusso di acqua a questo serbatoio, lo scarico dell'acqua in eccesso inclinando il serbatoio all'indietro e rimuovere il serbatoio accuratamente dal sistema. Lo sporco e la crescita delle alghe saranno evidenti sul fondo e sui lati del serbatoio.
5. Posizionare il deflettore in un serbatoio pulito, e riempire con acqua de-clorurati (aka sistema water). Cura trasferire il pesce in questo serbatoio con una rete da pesca. Chiudere il coperchio e trasferire la targhetta con il nome del serbatoio. Disporre con attenzione il serbatoio pulito nel sistema e attivare la fornitura di acqua.
6. Per decontaminare la rete pesce, spruzzare con il 70% di etanolo, sciacquare in acqua, e lasciarlo asciugare prima di riutilizzare. Rimuovere il deflettore dal serbatoio sporco e spruzzare due parti con etanolo 70%. Sciacquare accuratamente con acqua di rubinetto e lasciare il serbatoio e deflettore per asciugare completamente prima di riutilizzare.
7. I filtri del sistema di circolazione deve essere controllato e sostituito regolarmente per garantire la loro funzione. Questi filtri devono essere cambiati regolarmente per garantire l'approvvigionamento idrico adeguato e pulita a tutti gli acquari.
8. Il 120-micron tampone filtro è solitamente riposizionato o sostituito giornalmente; riposizionare verso il flusso dell'acqua di utilizzare completamente prima di sostituire con uno nuovo.
9. Il filtro Canister deve essere cambiato ogni settimana. Per cambiare il filtro a canestro, rimuovere l'unità filtro ruotando formicaiclockwise con una chiave o con le mani. Posizionare un foglio di plastica o un asciugamano di seguito per evitare o assorbire fuoriuscite d'acqua. Sostituire il filtro a canestro con una nuova e rimontare il filtro di unità nel sistema, serrare accuratamente con le mani e una chiave, se necessario.
10. Il filtro a carbone deve essere sostituito ogni due settimane (ogni due settimane). Per cambiare il filtro a carbone, rimuovere l'unità filtro a carboni accuratamente con una chiave. Scartare il carbone attivo utilizzato e sostituirlo con nuovo carbone attivo. Rimontare il supporto di carbonio e rimettere poi il gruppo filtro. Rimontare il filtro dell'unità nel sistema. Accendere il sistema e controllare che l'acqua scorra al filtro. Se necessario, pulire l'acqua attraverso i tubi per pulire lo sporco nei tubi prima di montare il filtro nel sistema.
11. Il filtro biologico dovrebbe essere pulito ogni sei mesi. Un filtro biologico è generalmente situato tra il filtro e il filtro carbonio nel sistema di circolazione. Per cambiare il filtro biologico, remOve l'unità filtro dal sistema. Rilasciare la pressione dal filtro premendo il pulsante di rilascio della pressione. Svitare il filtro con una chiave. Generalmente sono necessarie due persone per questo passo. Rimuovere il coperchio dell'unità filtro. Svuotare il contenuto del filtro in un contenitore setacciata per separare il siporax dall'acqua. Nota: siporax è un bel poro bio-filtro dei media che ha la capacità di eseguire sia la nitrificazione e denitrificazione.
12. Se il siporax è molto sporca, sostituirla con una nuova. Riempire l'unità filtro con acqua di sistema (de-acqua clorata), chiudere il coperchio, restituire l'unità filtro per il sistema e attivare la fornitura di acqua. Nota: In un acquario acclimatati, il siporax sarà sede di numerosi batteri nitrificanti. Questi microrganismi sono fondamentali per il mantenimento del ciclo dell'azoto in acquario, e rimuovendo l'alloggiamento primario per il filtro biologico (la siporax sporco) può causare un picco di ammoniaca grave, seguito da un picco nitrito mentre il new filtro biologico (con siporax nuovo) è ristabilire. Entrambi questi stati intermedi del ciclo dell'azoto può essere tossico per gli organismi acquatici, e può uccidere zebrafish se non ha risposto in modo appropriato. Pertanto, è importante avere un filtro biologico secondario altrove nel sistema alloggiamento zebrafish (ad esempio, nella vasca di raccolta in Aquatic sistema habitat) per consentire una rapida ripopolazione di questi microrganismi importanti sul siporax nuovo.
13. Filtri UV sono utilizzati per controllare i contaminanti biologici di sistema (come batteri) e deve essere sostituito ogni 9-10 mesi. Va notato che filtro UV dose disinfezione è ~ 110 mJ / cm ^2, all'inizio della durata della lampada e la dose diminuisce nel corso del tempo, quindi è necessario sostituire il globo anche quando appare ancora funzionale.

2. Alimentazione

1. Zebrafish possono essere alimentati con alimenti secchi (dimensione cibo da 100 micron per t larveo 300/400 micron per i pesci adulti) o cibo vivo (artemie). Salamoia gamberetti (Artemia sp.) Le uova sono disponibili presso negozi di animali locali e possono essere nati in laboratorio, seguendo i semplici passi descritti di seguito.
   1. Sciogliere il sale in acqua di mare rosso invecchiato ponendo un becher con sale su un agitatore magnetico per una migliore solubilità. In alternativa, il sale può essere dissolto in acqua mediante aerazione con il tubo areatore. Sale marino istantanea può essere utilizzato anche come soluzione cova se rosso sale marino non è disponibile. Artemie possono tollerare una vasta gamma di salinità, tuttavia, ci schiudono il nostro gambero di salamoia (10-15 g) nel 30-35 g / L di acqua salata del mare rosso. Nota: In caso di uova di artemia salina non sono facilmente reperibili nei negozi di animali locali poi artemie incapsulati possono essere utilizzati anche dopo "decapping" in batch prima di aggiungerli all'incubatoio gamberetti. Questo potrebbe anche evitare di frequenti viaggi al negozio di animali.
   2. Riempire la schiusa artemie con salt acqua e aggiungere le uova gamberetti ad una concentrazione di 1,2 cucchiai / litro. Aerare la schiusa energicamente con una pompa ad aria e lasciare le uova salamoia gamberetti a schiudersi per ~ 48 ore.
      Nota: Si noti che il non-arricchito artemia perdere valore nutrizionale ogni ora dopo la schiusa. Pertanto, può essere opportuno o botola oltre 24 ore o arricchire oltre 48 ore in modo da ottenere il massimo valore nutritivo dal artemie.
   3. Acque di scarico dal sistema di schiusa viene aggiunto ai rifiuti quarantena per essere disinfettate con candeggina e disposto in seguito.
2. Per raccogliere le artemie, rimuovere il tubo dell'aria e consentire la cultura riposare per 4-5 minuti, ma non per più di 10 min. Le artemie tratteggiate si riuniscono nella parte inferiore della Hatcher.
   1. Raccogliere artemie con il rubinetto in fondo della schiusa. Eliminare il flusso iniziale che consiste di uova salamoia non-nati gamberetti.
   2. Dopo aver scartato i non-nati artemie, raccogliere le artemie nati che saranno utilizzati come cibo zebrafish.
   3. Separare le artemie dall'acqua salata, con una rete di salamoia gambero raccolta (~ 350 micron maglia di nylon). Lavare i gamberetti salamoia dalla rete in un contenitore con acqua del sistema.
3. Le artemie raccolti sono generalmente presenti in elevata concentrazione sul fondo del contenitore dando un colore piuttosto arancione.
4. Inserire le artemie al zebrafish utilizzando una pipetta o un contagocce / squeezy bottiglia. La quantità di cibo erogato dipende dalla dimensione della popolazione singoli serbatoi. Il rapporto comunemente accettato per zebrafish è ricevere 4% del peso corporeo in alimento al giorno. Zebrafish non dovrebbe mai essere sovralimentati in quanto ciò può aumentare il livello di nitrati nell'acqua, la riduzione dei suoi allevamento, o la vitalità, come alcuni pesci possono morire a causa di eccesso di cibo.
   1. Dopo l'iniezione di cibo nelacqua, nuotano pesci affamati per prendere le artemie.
5. Alimentazione a secco può essere effettuata utilizzando un ecosistema acquatico di / habitat acquatici semplice molla a base di dispenser cibo per pesci. In alternativa, l'alimentazione secca può anche essere eseguita usando un semplice cucchiaio o tagliando un contagocce di plastica diagonalmente con le forbici per dare un aspetto di un cucchiaino.

3. Allevamento

1. Zebrafish avviare allevamento all'inizio della luce. Uova fecondate può essere ottenuta o attraverso in-vasca di allevamento o di allevamento a coppie. Mentre nella vasca di allevamento è più lavoro efficiente e che sia attuato raccolta di embrioni regolare nel nostro laboratorio, allevamento a due a due è preferibile quando i geni o mutazioni devono essere sottoposti a screening di singoli pesci.
2. Per in-vasca di allevamento, montare il serbatoio in allevatore e rilasciare lentamente nella vasca di pesci dopo l'inizio della luce. In alternativa, nella vasca da riproduzione di set-up può essere lasciato durante la notte nella vasca dei pesci.
3. Lgronda in-serbatoio allevatore per circa 15 min per permettere il pesce di accoppiarsi prima di rimuovere l'allevatore dal serbatoio e raccolta delle uova.
4. Allevamento a coppie in genere costituito nel tardo pomeriggio dopo il pasto.
5. Montare il serbatoio allevamento e riempirlo con acqua sistema invecchiato.
6. Trasferire una femmina e un maschio per lati opposti della vasca di riproduzione. Femmine possono essere distinte da maschi a causa della loro grande ventre. I maschi possono anche essere distinti dalle femmine perché sono più sottili e di colore più scuro rispetto alle femmine. Inoltre, i maschi hanno colorazione più giallo nella pinna anale rispetto alle femmine (vedi Figura 1). Quando nel look dubbio per l'ovopositore in zebrafish femminile (vedi Figura 4).
7. Rimuovere il divisore la mattina seguente poco dopo l'inizio della luce. Consentire l'accoppiamento a verificarsi indisturbata per 20 minuti o fino a quando un numero sufficiente di embrioni sono fissate al fondo del serbatoio.
8. Dopo l'allevamento,riportare il pesce per i loro carri armati. Raccogliere le uova con un colino.
9. Lavare gli embrioni accuratamente con acqua del sistema.
10. Trasferire gli embrioni ad una piastra di Petri risciacquando il filtro con mezzo embrione alias EM3 (NaCl, 13,7 mM, KCl, 0,54 mM; MgSO _4, 1,0 mM, CaCl _2, 1,3 mM, Na ₂ HPO _4, 0,025 mM, KH ₂ PO _4, 0,044 mM, _NaHCO3, 4,2 mm).
11. Embrioni possono essere osservati al microscopio. Ovuli fecondati vengono separate dalle uova fecondate utilizzando un ago e una pipetta (vedi Figura 3).

4. Allevamento di larve

1. Uova fecondate sono conservati in un incubatore (~ 28.5 ° C) per 72 ore fino a quando le larve sono schiuse.
2. Ora le larve sono fuori dal corion e nuotare liberamente sono pronti a trasferire in un acquario principale. Le larve hanno bisogno di essere nutriti da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) e sono tenuti in mezzo embrione (composizione descritta inParte 3, 10) o acqua sistema. Larve possono essere tenuti in piatti rotondi con ~ 50% o più di acqua in esso cambiata su base giornaliera. Il cambio d'acqua dovrebbe includere la rimozione di larve morte o malate e altri detriti.
3. Trasferire le larve dolcemente in un serbatoio contenente un deflettore di piccole dimensioni (circa 300-400 micron). Larve morte e malato deve essere rimosso e qualche millilitro di acqua dovrebbe essere aggiunto lentamente su una base quotidiana.
4. Dopo 14 giorni, i carri armati larve può essere archiviato nel sistema, e fornito con un flusso d'acqua in bicicletta (1-2 gocce al secondo). Come le larve crescono, il flusso d'acqua può essere aumentata. Diverse dimensioni di deflettori può essere utilizzato a seconda delle dimensioni delle larve (deflettore esempio dimensione 300-400, 500, 700-750, e 1000 micron) e un deflettore di plastica normale dovrebbe essere utilizzato per il pesce adulto.
5. Di solito ci vogliono 3 mesi per gli embrioni di svilupparsi in adulti sessualmente maturi.

Risultati

Alloggiamento Zebrafish e la manutenzione è più facile e meno costoso rispetto ai modelli tradizionali di roditori. Diverse migliaia zebrafish può essere alloggiato in un piccolo laboratorio. Come risultato di questo protocollo, i ricercatori saranno in grado di gestire un impianto zebrafish che fornirà condizioni sani al zebrafish. Inoltre, le seguenti figure aiuterà uova fecondate identificare, zebrafish adulti, e il loro cibo. L'illustrazione di un pesce zebra maschio (Figura 1A) e zebrafish femminile (Figura 1B e 1C) è indicato per aiutare i ricercatori a distinguere tra un maschio e una femmina per l'allevamento di pesce zebra scopo la figura 2 illustra una visione microscopica,. Artemie a 12X (Figura 2A), un gambero di salamoia singolo a 90X (Figura 2B), e un uovo non fecondato artemia a 90X (Figura 2C). Questo aiuterà a capire la differenza tra artemie non fecondate e fecondato per proper mangimi. Uova fecondate e non fecondato sono mostrati in Figura 3. Figura 3A illustra una vista microscopico di embrioni fecondati e non fecondato. Embrioni non fecondate sono generalmente opachi e / o con celle rottura (s) all'interno del corion (freccia nera) mentre embrioni fecondati appare intatto e crescente allo stato successivo divisione cellulare (per la lettura dettagliata delle diverse fasi embrioni di zebrafish vedi ^1). Vista ingrandimento superiore di una figura fecondato e un ovulo non fecondato è mostrato in figura 3B e 3C, rispettivamente. 4 illustra un ovopositore zebrafish femminile per aiutare i ricercatori a distinguere tra un maschio e una femmina zebrafish.

Diversi problemi critici che potrebbero verificarsi in un laboratorio zebrafish includono il blocco di approvvigionamento di acqua ad una persona / tutti i serbatoi del sistema di allevamento, cattiva qualità dell'acqua, e le perdite in tubazioni o serbatoio del sistema di circolazione. Inoltre,problemi per ottenere embrioni da allevamento potrebbe essere un altro problema. Risoluzione dei problemi di questi aspetti è discusso di seguito.

Figura 1. L'illustrazione di un pesce zebra maschio (A) e femminile zebrafish (B, C).

Figura 2. Un punto di vista microscopico di artemie a 12X (A), un gambero di salamoia singolo a 90X (B), e un uovo non fecondato artemia a 90X (C).

Figura 3. Vista microscopico (16X) di uova fecondate e non fecondato, in cui vengono fecondate solo due uova, le uova non fecondate sono indicate con frecce nere (A). Maggiore ingrandimentoview (90X) di un fecondato (B) e un uovo fecondato (C).

Figura 4. Un pesce zebra femmina ovopositore (indicata con la freccia nera) illustrazione.

Parametro	Gamma ottimale
Alcalinità	50-150 mg / L CaCO3
pH	6,8-7,5 (6,0-8,5 tollerata)
Temperatura	26-28,5 ° C
Durezza	50-100 mg / L CaCO3
Un-ionizzato Ammoniaca	<0,02 mg / L
Nitrato (NO 3 -)	<50 mg / L
Nitriti (NO 2 -)	<0,1 mg / L
Di ossigeno disciolto	> 6,0 mg / L
Salinità	0,5-1 g / L
Conducibilità	300 -1500 mS

Tabella 2. Parametri di qualità dell'acqua. Qualità dell'acqua parametri. Intervallo ottimale di parametri ambientali in acquario zebrafish ^11.

Discussione

Zebrafish provengono dal fiume Gange nel nord dell'India e stanno diventando sempre più popolare nel campo della ricerca, sia con gli adulti e stadi larvali ^2, recensione da Spence et al. ^3. Zebrafish in possesso di diversi vantaggi rispetto ad altri modelli animali, come fecondità elevata, facilità di manutenzione, la clearance ottica di embrioni, il rapido sviluppo embrionale, e bassi costi di manutenzione. Esse sono suscettibili di manipolazione genetica ⁶ e adatto per high throughput screening di farmaci ^4,5. Loro fecondazione è esterna che è vantaggioso per il loro uso da biologi dello sviluppo. Grazie a queste caratteristiche favorevoli, pesce zebra stanno guadagnando popolarità in genetica ^7, farmacologico ⁸ e ricerca comportamentale ^9,10. Ci sono una serie di sfide per mantenere un impianto di zebrafish e allevamento zebrafish per ottenere embrioni. Qui, descriviamo le nostre esperienze e le raccomandazioni per affrontare queste sfide e outline un protocollo per la manutenzione del sistema, alimentazione, allevamento e raccolta delle larve.

Manutenzione del sistema

Per mantenere zebrafish in condizioni di buona salute, è importante fornire loro un ambiente pulito in un sistema di acquario ben funzionante. Una parte importante di questo sistema sta cambiando filtri regolarmente in modo che tutti i serbatoi ricevono corretto flusso d'acqua e acqua pulita. E 'fondamentale per evitare il fallimento della fornitura d'acqua in bicicletta per ogni serbatoio a causa di tubi di sistema bloccati. I tubi possono essere puliti con una portata superiore a quella normale, la pressione dell'acqua e se il blocco si verifica. Idealmente, circa il 10% di acqua del sistema dovrebbe essere sostituito ogni giorno per mantenere una buona qualità dell'acqua. In alternativa, l'acqua può essere sostituito durante la sostituzione della scatola metallica o di un filtro al carbonio. Questo assicura che lo sporco depositato nei tubi di collegamento questi filtri viene rimosso. La qualità dell'acqua deve essere controllata regolarmente. Parametri come l'alcalinità, pH, temperature, durezza, ammoniaca, ossigeno disciolto, salinità, conducibilità e dovrebbe essere considerata come fattori importanti che rappresenta la qualità dell'acqua dell'impianto (vedi Tabella 2 per i dettagli). Al nitrato meno, il pH e la temperatura devono essere monitorati regolarmente per garantire una buona qualità dell'acqua per zebrafish abitazioni. Ideale nitrato (NO ^{3 -)} livelli sono <50 mg / L ^11; alta se questi livelli può essere ridotto sostituendo l'acqua nel sistema di circolazione con il sistema di acqua fresca. Di tanto in tanto, i filtri non si adattano bene e perdere quindi si consiglia di verificare la presenza di eventuali perdite dopo una sostituzione del filtro. Se il flusso di acqua dal serbatoio principale è bloccato o dopo aver cambiato la pompa dell'acqua o sostituire un filtro, il flusso d'acqua può essere ripristinata o allentare o rimuovere il filtro per alcuni secondi per rilasciare il vuoto viene generato nei tubi. Il tempo necessario per cambiare i filtri possono variare a seconda di vari fattori come il carico totale o biologican il sistema, la pulizia di filtri altri, e lo sporco depositato nei tubi. Di conseguenza, i filtri devono essere immediatamente sostituiti se appaiono sporchi o se tutti i serbatoi non ricevono la corretta alimentazione dell'acqua. Si raccomanda inoltre che il pesce netto essere puliti con etanolo al 70%, e risciacquato con acqua per decontaminare, e lasciati asciugare prima di essere riutilizzati. Essiccazione garantisce evaporazione di etanolo che altrimenti è tossico per i pesci.

La maggior parte dei sistemi di zebrafish utilizzare de-clorurati acqua del rubinetto, ma alcuni sistemi usare acqua deionizzata. È importante mantenere la conducibilità dell'acqua di sistema tra 300 e 1.500 ~ mS quanto riduce l'energia del pesce deve mantenere sali corporei. Pertanto, zebrafish non può essere conservato in acqua deionizzata a meno sali sono aggiunti per mantenere i livelli ottimali di conducibilità. Vi è il rischio di possibili concentrazioni elevate di rame in acqua di rubinetto sistema se viene utilizzato perché il filtro al carbone non rimuove rame. Pertanto, users dovrebbe verificare per le concentrazioni di rame e tubazioni di rame evitare, ove possibile.

Alimentazione

Zebrafish non dovrebbe mai essere sovralimentati in quanto ciò può aumentare il livello di nitrati nell'acqua, la riduzione dei suoi allevamento ^11, o la vitalità, come alcuni pesci possono morire a causa di eccesso di cibo. Si consiglia di fornire più cibo nel corso di uno di alimentazione di un serbatoio di pesce può finire in 10 minuti. E 'molto importante per eliminare il sale dai artemie prima di espellerle alla zebrafish come concentrazione di sale in eccesso provoca la morte. Se uova zebrafish sono necessari più, pesce può essere alimentato tre volte al giorno. Pulizia dei serbatoi allevatore di pesce tutti i giorni migliora anche i livelli di produzione di uova.

Durante l'alimentazione sui sistemi acquatici habitat di solito spegnere la pompa dell'acqua e la pompa d'aria per permettere al pesce di mangiare il cibo per 10 minuti. Questo diminuisce la quantità di cibo che viene lavata nei filtri. Tuttavia, gli utenti devono fare attenzione a remEmber per accendere queste pompe di nuovo in seguito.

Allevamento

Zebrafish sono di solito in condizioni di allevamento ottimale tra ~ 3 e 18 mesi di età. Allevamento a coppie non deve essere eseguita per due giorni consecutivi, ^11; tuttavia, in vasca da riproduzione può essere effettuata tutti i giorni come un serbatoio può contenere molti pesci che riduce la possibilità della stessa coppia di pesci vengono allevati per due giorni di fila. Allevamento dovrebbe essere effettuata ad intervalli regolari, anche se le uova non sono necessarie. Questo processo assicurarsi che il ciclo di allevamento del pesce è mantenuta. Si raccomanda che non ci sono più femmine che maschi in un allevamento di set-up. Zebrafish Maschio cambiare le loro partner femminili su un ¹² base giornaliera che supporta ulteriormente questa raccomandazione. Inoltre, nel nostro laboratorio abbiamo inizialmente avuto problemi con l'allevamento, tuttavia, utilizzando più femmine che maschi in un allevamento di set-up aiutato a risolvere il problema. Inoltre, alimentando con una proteina conte altont dieta e artemia due-tre volte al giorno, pesce di miscelazione da serbatoi diversi (diversi dai genitori), mantenendo la temperatura del allevamento set-up tra 27 e 28 ° C, e stringendo la pancia delle femmine con tubi ovariche bloccate con leggero massaggio ulteriormente migliorato la produzione di uova. Si consiglia di mantenere una registrazione di linee di pesce / origini per evitare in-allevamento tra fratelli. Questo incrementa la produzione di embrioni. Mantenere una registrazione del numero di embrioni di cui cattura di pesci di ogni serbatoio è anche raccomandato. Questo aiuta a mantenere una traccia delle vasche di allevamento dei pesci migliori e prendere misure volte a migliorare l'allevamento del pesce non deporre le uova.

Allevamento di larve

Alimentazione delle larve dovrebbe iniziare da 5 dpf (giorni dopo la fecondazione). Larve giovani possono essere nutriti con cibo secco di circa 100 micron di dimensione (ad esempio, ZM100) o cibo vivo come paramecio e rotiferi (che stimola la crescita). La dimensione cibo può essere aumentata lentamentea 200 micron (es. ZM200) o 300/400 micron (es. ZM300). Una popolazione di pesci adulti dovrebbe essere di circa 6-7 pesci per litro d'acqua. Questa pratica è consigliata per una migliore manutenzione della BOD (domanda biologica di ossigeno) ai serbatoi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo
Zebrafish sistema di circolazione	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	Achab stand-alone, da banco sistemi
Bicarbonato di Sodio	Sigma Aldrich	S6297
Pesce dispenser cibo / alimentatore cibo secco	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	AH19
Microscopio	Olimpo	SZX12
Cibo secco	ZM cibo per pesci, Regno Unito	ZM100, ZM200, ZM300
Salamoia gamberetti uova	Salt Creek, Inc., USA	Premium Grade
In-tank allevatori	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	ITSTS-A
Carbone attivo	Penn-Plax Pro-granchio, Stati Uniti d'America	PBC3MF
Allevamento serbatoi	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	SBTANK (1L) Allevatore Tank-2 (2L)
Red sale marino	Red sale marino, Stati Uniti d'America	Negozio di animali locale / www.redseafish.com
Filtri (scatola metallica, pastiglie filtro e UV)	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	aquatichabitats.com
Siporax media	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	BF 820
Brine shrimp net	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	BSN1
Brine shrimp schiusa	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	BS252
Baffles	Habitat acquatici, Stati Uniti d'America	aquatichabitats.com
			Tabella 1. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche utilizzati in questo protocollo.