Compact Quantum Dots per singola molecola Imaging

Riepilogo

Si descrive la preparazione di punti quantici colloidali con minimizzata dimensione idrodinamica per singola molecola imaging di fluorescenza. Rispetto ai tradizionali punti quantici, queste nanoparticelle sono di dimensioni simili alle proteine ​​globulari e sono ottimizzati per singola molecola luminosità, stabilità contro la fotodegradazione, e resistenza al legame non specifico a proteine ​​e cellule.

Abstract

Singola molecola di imaging è uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi di funzionamento biomolecolare e per visualizzare l'eterogeneità spaziale e temporale dei comportamenti molecolari che sono alla base della biologia cellulare ^1-4. Esporre una singola molecola di interesse, è tipicamente coniugato ad un tag fluorescente (colorante, proteine, perlina, o quantum dot) e osservato con epifluorescenza o totale riflessione interna fluorescenza (TIRF) microscopio. Mentre coloranti e proteine ​​fluorescenti sono state il pilastro di immagini a fluorescenza per decenni, la loro fluorescenza è instabile in alto fondenti fotoni necessari per osservare singole molecole, ottenendo solo pochi secondi di osservazione prima completa perdita di segnale. Perle di lattice e perline dye-etichettati fornire stabilità del segnale migliorata, ma a scapito della dimensione idrodinamica drasticamente più grande, che può alterare deleteria la diffusione e il comportamento della molecola in esame. S copi "> Punti quantici (QD) offrono un equilibrio tra questi due regimi problematici. Queste nanoparticelle sono composti da materiali semiconduttori e può essere costruito con un idrodinamico compatto con eccezionale resistenza alla fotodegradazione ^5. Così, nel corso degli ultimi anni QD sono state fondamentali per consentire osservazione a lungo termine del comportamento complesso macromolecolare a livello di singola molecola. Tuttavia, queste particelle sono ancora stati trovati esporre diffusione ridotta in ambienti affollati molecolari come il citoplasma cellulare e la fessura sinaptica neuronale, in cui le loro dimensioni sono ancora troppo grandi ^{4,6 , 7.}

Recentemente abbiamo progettato i nuclei e rivestimenti per superfici di QD per ridurre al minimo dimensioni idrodinamico, mentre il bilanciamento offset per la stabilità colloidale, fotostabilità, luminosità, e vincolante non specifici che hanno impedito l'utilità di QD compatti in passato ^8,9. L'obiettivo di questo articolo è quello di dimostrarela sintesi, la modifica e la caratterizzazione di questi nanocristalli ottimizzate, composto da una lega Hg Cd _{x 1-x} Se nucleo rivestito con un isolante Zn Cd _{y 1-y} shell S, ulteriormente rivestito con un legante polimerico multidentati modificato con polietilenglicole corta ( PEG) catene (Figura 1). Rispetto ai nanocristalli CdSe convenzionali, Hg Cd _{x 1-x} leghe selenio offrire maggiori rese quantiche di fluorescenza, fluorescenza a lunghezze d'onda rosse e nel vicino infrarosso per una maggiore rapporto segnale-rumore nelle cellule, e di eccitazione a lunghezze d'onda visibili non citotossiche. Multidentati rivestimenti polimerici legarsi alla superficie nanocristallo in una conformazione chiusa e piana di minimizzare la dimensione idrodinamica, PEG e neutralizza la carica superficiale per ridurre il legame non specifico di cellule e biomolecole. Il risultato finale è un nanocristallo brillantemente fluorescente con emissione tra 550-800 nm e una dimensione idrodinamica totale vicino a 12 nm. Questo è in same gamma di dimensioni, come molte proteine ​​globulari solubili nelle cellule, e di dimensioni notevolmente inferiori rispetto ai tradizionali QD pegilato (25-35 nm).

Protocollo

Le procedure di sintesi seguenti comporta standard di aria libere tecniche e l'uso di un vuoto / collettore gas inerte; metodologia dettagliata può essere trovata in riferimenti 10 e 11. Scheda di sicurezza per tutte le sostanze potenzialmente tossiche e infiammabili deve essere consultata prima dell'uso e composti tutti infiammabili e / o aria-labile deve essere frazionato in setto-fiale sigillate in un vano portaoggetti o borsa guanto.

1. Sintesi di seleniuro di cadmio mercurio (Hg Cd _{x 1-x} Se) Quantum Dot Nuclei

1. Preparare una soluzione 0,4 M di selenio in trioctylphosphine (TOP). Aggiungere selenio (0,316 g, 4 mmol) ad una 50 ml a 3 colli pallone, poi evacuare e riempire con argon usando una linea Schlenk. Sotto aria senza condizioni (azoto secco o argon), aggiungere 10 ml TOP e calore a 100 ° C sotto agitazione per 1 ora per ottenere una soluzione limpida, incolore. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e impostare il matraccio da parte.
2. Per 250 ml a 3 colli pallone, aggiungere ossido di cadmio (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), acido tetradecylphosphonic (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol), e octadecene (ODE, 27,6 ml), ed evacuare la soluzione utilizzando una linea Schlenk agitando. Aumentare la temperatura a 100 ° C ed evacuare per altri 15 minuti per rimuovere impurità bassobollenti point.
3. Sotto argon o azoto, riscaldare la miscela a 300 ° C per 1 ora per sciogliere completamente la CdO. La soluzione cambierà da un colore rossastro al trasparente ed incolore. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
4. Aggiungi esadecilammina (HDA, 7,0 g) alla soluzione cadmio, riscaldare a 70 ° C, ed evacuare. Una volta che una pressione costante viene raggiunta, aumentare la temperatura a 100-110 ° C e la soluzione riflusso per 30 min. Commutare la valvola linea Schlenk a gas inerte e inserire la termocoppia direttamente nella soluzione.
5. Sotto aria senza condizioni, aggiungere diphenylphosphine (DPP, 100 pl) alla soluzione e aumentare la temperatura a 310 ° C. Rimuovere 7,5 ml di M 0.4 TOP-Se la soluzione(3 selenio mmol) in una siringa di plastica monouso collegato a un ago calibro 16.
6. Una volta che la temperatura si equilibra a 310 ° C, impostare il regolatore di temperatura a 0 ° C e rapidamente iniettare il TOP-Se la soluzione direttamente nella soluzione di cadmio. La soluzione passa da incolore a giallo-arancio e la temperatura rapidamente scendere e aumentare di nuovo a ~ 280 ° C. Dopo 1 min di reazione, allontanare il pallone dal mantello riscaldante e raffreddare velocemente con un flusso di aria fino a quando la temperatura è inferiore a 200 ° C.
7. Quando la temperatura raggiunge i 40 ° C, diluire con 30 ml di esano, la maggior parte del precursore cadmio rimanente depositarsi di soluzione. Rimuovere questo precipitato mediante centrifugazione (5000 xg, 10 min).
8. In ciascuna delle sei tubo da 50 ml conica in polipropilene da centrifuga, diluire 12 ml della soluzione grezza nanocristalli con 40 ml di acetone, centrifuga (5.000 xg per 10 minuti), e con attenzione decantare ed eliminare il surnatante.
9. Sciogliere il nanocrpellets ystal in esano (25 ml di volume totale). Estrarre questa soluzione 3 volte con un uguale volume di metanolo, mantenendo la fase superiore. Per la terza estrazione, il volume di metanolo può essere regolata per ~ 15 ml per ottenere una soluzione concentrata di esano QD CdSe puri a circa 200 pM. La resa tipica di questa reazione è 3 micromole di nanocristalli CdSe con un diametro di 2,3 nm (50-60% resa di reazione).
10. Determinare il diametro di nanocristalli e la concentrazione misurando la UV-Vis spettro di assorbimento e la consultazione delle dimensioni-montaggio grafico di Mulvaney e collaboratori ¹² e le correlazioni di estinzione Bawendi e collaboratori ^13. Vedi Appendice per i dettagli.
11. Di scambio cationico Mercury: i nanocristalli possono essere parzialmente scambiate con il mercurio al rosso-spostare l'assorbimento e l'emissione di fluorescenza. Mescolare il seguente insieme in ordine in una fiala di vetro da 20 ml con stirbar (questa reazione può essere scalata a piacere): 3 ml di esano, 2 ml di cloroformio, 1 ml 200 uM CdSe QD soluzione (200 nmol), 15 microlitri oleilammina (OLA), e 500 microlitri di una soluzione 0,1 M di Hg (OT) ₂ in cloroformio. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ possono essere preparati facendo reagire acetato di mercurio e octanethiol in metanolo (vedi appendice). Con il procedere della reazione di scambio cationico, il grado di spostamento verso il rosso può essere monitorato con UV-Vis spettrofotometria di assorbimento. Dopo la banda di assorbimento desiderato è stato raggiunto, misurare l'assorbimento della soluzione nanocristallo a 350 nm e determinare il nuovo coefficiente di estinzione, assumendo che la concentrazione nanocristallo non è cambiata (30,7 pM in questo esempio). Estinguere la reazione rimuovendo il mercurio non reagito: aggiungere 5 ml decano, 10 ml di esano, e 7 ml di metanolo ed estrarre la soluzione, mantenendo la fase superiore contenente i nanocristalli. Estratto due volte con esano e metanolo, e regolare il volume di metanolo in modo che la fase superiore è ~ 7 ml. Se le fasi sono lenti a separare, la soluzione può essere centrifugati (5000 xg,10 min). Aggiungere 100 microlitri TOP, 100 microlitri OLA, e 100 microlitri di acido oleico ai nanocristalli seguiti da 40 ml di acetone per indurre la precipitazione. Raccogliere i nanocristalli mediante centrifugazione e si disperdono in 3 ml di esano. Centrifugare nuovamente per rimuovere i componenti insolubili e determinare la concentrazione nanocristallo nuovamente, utilizzando il coefficiente di estinzione nuovo a 350 nm. Consentire alla soluzione nanocristallo invecchiare per almeno 24 ore a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva.

2. Crescita di solfuro di cadmio di zinco (Zn Cd _{y 1-y} S) Shell

1. Preparare 0,1 m soluzioni precursori shell in 50 ml a 3 colli palloni. Cadmio precursore: acetato idrato cadmio (230,5 mg, 1 mmol) e 10 ml oleilammina (OLA). Zinco precursore: acetato di zinco (183,5 mg, 1 mmol) e 10 ml OLA. Precursore zolfo: zolfo (32,1 mg, 1 mmol) e 10 ml ODE. Sotto vuoto, riscaldare ogni soluzione a riflusso per 1 ora per ottenere soluzioni chiare, e poi caricare con argon. La soluzione di zolfo puòessere raffreddata a temperatura ambiente, ma i precursori cadmio e zinco sono mantenuta a circa 50 ° C. I calcoli di quantità precursori shell si possono trovare in riferimento 14.
2. Aggiungi a un pallone a 3 colli: Hg Cd _{x 1-x} Se QD (120 nmol, 2.3 nm di diametro), ODE (2 ml), e trioctylphosphine ossido (TOPO, 250 mg). Evacuare fuori esano a temperatura ambiente utilizzando la linea Schlenk. Aumentare la temperatura a 100 ° C sotto riflusso per 15 min. Modificare la valvola della linea di Schlenk argon o azoto e inserire la termocoppia nella soluzione nanocristalli.
3. Aumentare la temperatura a 120 ° C, aggiungere 0,5 monostrati di soluzione di precursore di zolfo (140 pl), e consentire la reazione per 15 min. Piccole aliquote (<50 pl) può essere rimosso usando una siringa di vetro per monitorare l'andamento della reazione mediante fluorescenza e / o UV-Vis spettrofotometria di assorbimento. Aumentare la temperatura a 140 ° C, aggiungere 0,5 monostrati di soluzione precursore cadmio (140 pl), e consentire la reazione per 15 min. Aggiungere 500 pl anidro OLA alla soluzione di reazione.
4. A 160 ° C aggiungere 0,5 monostrati di soluzione di precursore di zolfo (220 microlitri) seguita da una pari quantità di soluzione di precursore di zinco a 170 ° C con 15 min tra ogni aggiunta. Poi a 180 ° C aggiungere 0,25 monostrati di soluzione di precursore di zolfo (150 ml) e soluzione di precursore di zinco in intervalli di 15 min.
5. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e ancora calcolare un nuovo coefficiente di estinzione per queste particelle utilizzando un spettro UV-Vis, supponendo che il numero di nanocristalli non è cambiata (120 nmol in 3,8 ml di soluzione di reazione). Conservare la soluzione di reazione come una miscela grezza in un congelatore, i nanocristalli possono essere scongelate e purificato come necessario utilizzando lo stesso metodo descritto nelle sezioni 1.8 e 1.9.
6. I nanocristalli possono essere caratterizzati mediante microscopia elettronica, spettroscopia UV-Vis di assorbimento, e la spettroscopia di fluorescenza. Resa quantica può essereassolutamente calcolato utilizzando una sfera di integrazione o relativamente rispetto ad uno standard noto utilizzando i metodi di riferimento 15.

3. Fase di trasferimento

1. Aggiungere purificato nucleo / guscio Hg _x Cd _1-x Se / Zn Cd _{y 1-y} S QDs (5 ml, 20 pM) per un 50 ml a 3 colli pallone e rimuovere la esano sotto alto vuoto per ottenere un film secco. Riempire il pallone con argon, aggiungere piridina anidra (3 ml) al film nanoparticelle e calore dello slurry a 80 ° C. Nel corso di 1-2 ore le nanoparticelle si dissolvono completamente.
2. Aggiungere 1-tioglicerolo (1 ml) alla soluzione e agitare a 80 ° C per 2 h. Quindi raffreddare la soluzione a temperatura ambiente ed aggiungere trietilammina (0,5 ml) a deprotonate tioglicerolo. Agitare per 30 min. La soluzione può diventare torbida dopo l'aggiunta di trietilammina a causa della scarsa solubilità dei nanocristalli polari in questa miscela solvente.
3. Trasferire la soluzione QD in un cont centrifuga da 50 ml tubo conicoaining una miscela di 20 ml di esano e 20 ml di acetone, e mescolare bene. Isolare i nanocristalli precipitati tramite centrifugazione (5000 xg, 10 min), e lavare il pellet con acetone.
4. Sciogliere il precipitato QD in DMSO (5 ml) con sonicazione vasca, e quindi centrifuga (7000 xg, 10 min) per rimuovere eventuali aggregati. Determinare la concentrazione delle nanoparticelle da un UV-Vis spettro di assorbimento. Questa soluzione di QD puri deve essere usato entro 3 ore, come i tioli di superficie può lentamente ossidare in condizioni ambientali in aria.
5. Diluire la soluzione QD a 10 pm o meno con DMSO e trasferirla in un pallone tarato da 50 ml. Preparare a 5 mg / ml soluzione di tiolato acido poliacrilico (sintesi descritta in appendice) in DMSO. Aggiungere la soluzione di polimero (0,15 mg di polimero per nmol QD) goccia a goccia alla soluzione sotto agitazione QD e degassare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min.
6. Spurgare il QD / polimero soluzione con argon e scaldare a 80 ° C per 90 min. Quindi raffreddare la soluzione a temperatura ambiente und gocciolata aggiungere un volume uguale di 50 mM di sodio borato, pH 8. Agitare per 10 min.
7. Purificare le QDs tramite dialisi (20 kDa cutoff) in 50 mM di sodio borato, pH 8, e quindi concentrare le particelle utilizzando un filtro centrifugo (10 kDa cutoff). Determinare la concentrazione di raggi UV-Vis spettro di assorbimento.

4. PEG Rivestimento

1. In una fiala di vetro da 4 ml con stirbar, mescolare 1 nmol QDs in tampone borato con un eccesso molare di 40.000 x 750 Da monoamino-polietilene glicole (30 mg, 40 umol). Se una funzionalità chimica specifica deve essere aggiunta ai nanocristalli (es idrazide o maleimide), esso può essere introdotto sostituendo una frazione del ammino-PEG con un eterobifunzionale amino-PEG (frazione molare 30% lavora generalmente bene). Diluire la soluzione nanocristalli a 1 micron con tampone borato. Questa reazione può essere ridotta come desiderato.
2. Preparare una soluzione fresca di DMTMM (20 mg, 72 umol) in DMSO (144 microlitri). Questa soluzione può essere brevemente riscaldata under un flusso di acqua corrente calda o immersi in un bagno di sonicazione per sciogliere completamente il DMTMM. Aggiungere rapidamente un eccesso molare 25.000 x di questa soluzione 0,5 M DMTMM (50 microlitri) alla soluzione QD ed agitare a temperatura ambiente per 30 min.
3. Ripetere il passaggio 4,2 più quattro volte per saturare la superficie nanocristalli con PEG. Infine, aggiungere 200 microlitri di tampone Tris 1 M per placare la reazione e purificare i nanocristalli con dialisi, filtri centrifughi, o ultracentrifugazione.
4. I nanocristalli possono essere analizzati per monodispersity, dimensione idrodinamica, e carica superficiale usando cromatografia liquida, elettroforesi su gel di agarosio, e microscopia a fluorescenza. Per determinare la dimensione idrodinamica e distribuzione dimensionale usando un sistema automatizzato cromatografia liquida (GE AKTAprime Plus), utilizzare una colonna Superose 6, una velocità di flusso di 0,5 ml / min con eluente tampone PBS, e rilevazione assorbimento a 260 o 280 nm. Confrontare i tempi di eluizione nanoparticelle con quelli di standard di peso molecolare. Per gel di agarosio electrophoresistenza, preparare un gel di agarosio 0,5% in tampone borato di sodio 50 mM (pH 8,5) o 50 mM tampone fosfato di sodio (pH 7,4), miscelare 1 pM campioni con il 10% di glicerolo e di carico in pozzi, e correre a 100 V per 30 min . Immagine i nanocristalli nel gel con una bacchetta UV mano o transilluminatore UV e per l'eccitazione di fluorescenza. Per le immagini a livello di nanocristalli singola molecola mediante microscopia a fluorescenza, diluire le particelle di 0,2 nM in tampone fosfato 10 mM, goccia 2,5 pl della soluzione su un vetrino di vetro, e depositarla un coprioggetto secondo sopra il tallone liquido di diffondere un film tra i coprioggetti. Immagine della superficie-bound particelle utilizzando un obiettivo ad alta apertura numerica (idealmente almeno 1.40) sia in modalità a epifluorescenza o TIRF con eccitazione a lunghezze d'onda tra 400-580 nm e un elettrone moltiplicatore di telecamere CCD. Parametri di imaging esatto varierà tra installazione microscopia.

Risultati

La figura 2 mostra l'assorbimento di rappresentanza e spettri di fluorescenza per nanocristalli CdSe Hg, Cd _{x 1-x} nanocristalli di Se dopo di scambio cationico, Hg e Cd _{x 1-x} Se / Zn Cd _{y 1-y} S nanocristalli dopo la crescita della conchiglia. I nanocristalli CdSe nucleo ha una resa quantica di fluorescenza vicino a 15% (compreso lunghezza d'onda di emissione deep-trap) ma questa efficienza scende a meno di 1% dopo mercurio scambio, probabilmente a causa di addebi...

Discussione

Rispetto ai tradizionali CdSe punti quantici, in lega ternaria Hg Cd _{x 1-x} nanocristalli SE può essere sintonizzato per dimensioni e lunghezza d'onda di fluorescenza in modo indipendente. La dimensione viene prima selezionata durante la sintesi di nanocristalli CdSe nuclei, e la lunghezza d'onda di fluorescenza viene scelto in una fase secondaria di scambio cationico mercurio, che non alteri sostanzialmente le dimensioni nanocristallo ^9. È importante permettere purificato Hg Cd _{x 1-x...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Selenio	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% puro, instabile in aria
Ossido di cadmio	Sigma-Aldrich	202894	Altamente tossico: l'uso cautela
Tetradecylphosphonic acido	PCI Sintesi	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Grado tecnico
Esadecilammina	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Piroforico
Mercurio acetato	Sigma-Aldrich	456012	Altamente tossico: l'uso cautela
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Forte odore
Acido oleico	Sigma-Aldrich	W281506
Zinco acetato	Alfa Aesar	35792
Cadmio acetato idrato	Sigma-Aldrich	229490	Altamente tossico: l'uso cautela
Oleilammina	Fisher Scientific	AC12954	Instabile in aria
Zolfo	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine ossido	Strem	15-6661	99%
Piridina	VWR	EM-PX2012-6	Anidro
Tioglicerolo	Sigma-Aldrich	M1753	Forte odore
Trietilammina	Sigma-Aldrich	471283	Anidro
Dialisi tubo	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Filtro centrifugo	Millipore	UFC801024	10 kDa di taglio
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-dimetossi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-idrato methylmorpholinium cloruro	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Più Sistema per cromatografia	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL cromatografia su colonna	GE Healthcare	17-5172-01
Agarosio, OmniPur	VWR	EM-2120
			Appendice Sintesi di mercurio octanethiolate: Aggiungere lentamente una soluzione di acetato di mercurio metanolo (1 eq.) Ad una soluzione sotto agitazione di 1-octanethiol (3 eq.) E idrossido di potassio (3 eq.) In metanolo a temperatura ambiente. Isolare il (II) octanethiolate mercurio precipitato mediante filtrazione, lavaggio due volte con metanolo e una volta con etere, e quindi asciugare sotto vuoto. Sintesi di multidentati polimero: Sciogliere acido poliacrilico (1 g, 1.773 Da) in 25 ml di dimetilformammide (DMF) in 150 ml pallone a tre colli e bolle con argon per 30 minuti. Aggiungere una soluzione anidra di cisteamina (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml di DMF. A temperatura ambiente sotto vigorosa agitazione, aggiungere lentamente diisopropilcarbodiimmide anidro (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) in 30 min, seguito da trietilammina (170 pl, 1,22 mmol), e consentire la reazione per 72 ore a 60 ° C. Aggiungi mercaptoetanolo (501 mg, 6,41 mmol) per spegnere la reazione, e mescolare per 2 ore a temperatura ambiente. Rimuovere DMF tramite evaporazione rotante ed isolare il polimero con l'aggiunta di una miscela 2:1 di acetone ghiacciato: cloroformio, seguito da centrifugazione. Sciogliere il polimero in ~ 5 ml di DMF anidra, filtro, nuovamente precipitato con etere dietilico, e ripetere. Asciugare il prodotto sotto vuoto e conservare sotto argon. Determinazione del diametro del nucleo CdSe: Dal UV-Vis spettro di assorbimento determinare la lunghezza d'onda del primo eccitone picco (λ, in nm), che è la più lunga lunghezza d'onda di picco (ad esempio circa 498 nm per CdSe in figura 2a), e utilizzare il dimensionamento curva di Mulvaney e collaboratori 12: Determinazione della concentrazione CdSe nanocristalli: Da un background-sottratto UV-Vis spettro di una soluzione otticamente trasparente di nanocristalli CdSe, determinare l'assorbimento a 350 nm. Diluizioni seriali possono essere utilizzati per determinare se l'assorbimento ottico è entro l'intervallo lineare di legge di Beer. La concentrazione nanocristallo (QD, in M) può essere determinata inserendo il diametro nanocristallo (D, in nm), il valore di assorbimento ottico (A 3SA), e la lunghezza del percorso cuvetta (l, in cm) nell'equazione seguente la correlazione empirica di Bawendi e collaboratori 13: